荧光PCR法检测石蜡标本中结核分枝杆菌的流程改进

张玲娜，周晶晶，王俏洋，蔡莺莺，甘梅富

结核分枝杆菌的检测对于有肉芽肿性炎特征组织病变的病理诊断具有重要的参考意义。目前，病理科常用的检测方法有基于细菌学的抗酸染色、金胺O荧光染色，基于分子病理学的PCR、Xpert MTB/RIF检测[1-2]等。其中荧光PCR技术具有敏感性高、特异性好、速度快，且价格实惠的特点，被广泛应用于大中型医院病理科福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE)组织的结核分枝杆菌的检测中[3-6]。由于石蜡组织标本中的病菌分布不稳定，以及存在核酸的交联、降解等因素，荧光PCR法的灵敏度虽然比抗酸染色高，但仍存在一定的假阴性及临界性的结果，作者在实践中发现，通过对核酸标本进行浓缩处理再上机，可以帮助改善上述问题，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料收集2020年～2021年浙江省台州医院存档的手术切除或者活检，病理诊断为肉芽肿性炎或凝固性坏死的石蜡标本364例，其中大标本242例，小标本122例。

1.2 仪器与试剂CV200真空离心浓缩仪购自北京吉艾姆公司，ABI7500荧光PCR仪购自ThermoFisher公司。核酸提取试剂(型号FFPE DNA)购自厦门艾德公司，结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)购自湖南圣湘公司。

1.3 方法

1.3.1DNA提取 使用一次性棉签、刀片、无菌镊子连续5 μm厚切片(大标本5张，小标本10张)置于无菌离心管中，采用核酸提取试剂(按试剂盒说明书操作，其中添加DTB与无水乙醇后，置于56 ℃中加热1 min再离心)进行DNA的提取，最后洗脱体积为40 μL。

1.3.2荧光PCR检测 将反应液、酶混合液、内标核酸以38 ∶2 ∶1的比例充分混匀成PCR-混合液，每管40 μL分装到八联管，最后加入5 μL DNA样本作为PCR反应模板上机检测。对于测定Ct值<37的样本，判定为结核分枝杆菌DNA阳性；37≤Ct值≤39的样本，为临界阳性；Ct值>39的样本，同时，内标检测为阳性(Ct值≤40)，判定为结核分枝杆菌DNA阴性；若内标Ct值>40或无显示，则该样本的检测结果无效，查找并排除原因，并对此样本进行重复实验。

1.3.3核酸浓缩 将364例标本荧光PCR检测得到的临界阳性病例、阴性但有翘尾病例以及曲线异常病例的DNA样本管(1.5 mL离心管)开盖置于真空离心浓缩仪中，开启真空泵、冷阱、浓缩仪1 500 r/min，26 ℃离心浓缩5 min；浓缩结束后闭上管盖，混匀离心备用。

2 结果

2.1 传统荧光PCR法检测情况364例中检出阳性150例，临界阳性7例，阴性207例，其中阴性病例中有13例略有翘尾现象(图1A)。本实验将临界阳性和有翘尾的20例归为临界病例。

2.2 改良荧光PCR法检测情况临界病例的核酸用真空离心浓缩仪浓缩5 min之后，再使用荧光PCR法检测，结果发现，原7例临界阳性病例，5例检出为明确阳性，2例为临界阳性；原13例阴性病例采用改良法检测后，3例检出为明确阳性，2例为临界阳性。4例临界阳性经重复确定为阳性病例。阳性病例中改良检测法荧光曲线相对更明显，Ct值明显小于传统检测法，更易于判断(图1B)。20例标本中，初始核酸浓度最小值17.7 ng/μL，最大值为557.1 ng/μL，平均浓度207.3 ng/μL，所有标本的内标VIC曲线均正常升起。

图1 传统和改良荧光PCR检测TB DNA扩增对比图：黄色曲线为阳性对照，绿色曲线为检测样本：A.传统荧光PCR法，TB DNA检测曲线有翘尾，但是在基线以下；B.改良荧光PCR法，TB DNA曲线CT值为36.8，结果为阳性

2.3 改良荧光PCR法特异性验证取4例无病变的正常组织，4例检测结果为结核分枝杆菌核酸强阳性的病例，同一批切片，提取DNA，同时进行浓缩操作，同时上机，发现4例正常组织检测结果全部为阴性，且没有任何翘尾现象；另外4例仍为强阳性，说明浓缩过程没有造成交叉污染。

3 讨论

随着越来越多医院的检测中心尤其是病理科自身建立起规范的PCR实验室，荧光PCR检测方法以其优越的敏感性、特异性、方便性，给结核分枝杆菌的病理诊断带来可喜的变革。本组364例标本中，93例进行了抗酸染色，仅10例阳性，而用荧光PCR法检测出了47例阳性。有研究[7]结合随访数据计算得出，荧光PCR法的灵敏度为71.3%，特异度为99.4%，准确率为79.1%，其中灵敏度、准确率远高于抗酸染色的41.5%、55.7%，实验中他们亦发现有16例随访明确为结核，抗酸染色阳性，荧光PCR法却未检测出阳性，重新分析其中有13例抗酸染色为单个菌阳性或可疑阳性，部分病例核酸扩增曲线有翘尾但未达到阳性标准。

由于不同石蜡组织标本中病菌分布差异较大，以及存在核酸交联、降解等不利因素，荧光PCR法仍存在一定比例的假阴性以及临界的情况。本组改良版核酸浓缩-荧光PCR法通过富集核酸，提高模板量，可有效减少由于组织含菌量太少、穿刺标本太少等导致的假阴性结果(13例临界标本中发现了5例假阴性)，另一方面也减少了临界病例数量。浓缩过程并没有增加交叉污染的机会，且操作简便，避免了资源浪费，提高了检测的准确性和灵敏度，为结核特别是不典型结核病的相关病理诊断提供更准确的依据。

另外，作者在预实验中发现以下几项注意点：(1)如果提取的核酸浓度过高，不建议继续浓缩，预实验结果表明如果浓缩后的核酸浓度超过1 000 ng/μL，有可能会导致内标VIC曲线异常，检测结果不可信；(2)核酸提取试剂的DTL溶液，即裂解液，可能含有SDS等明确会抑制PCR的强表面活性剂成分，在后续操作中务必去除干净，其中关键环节是样品添加DTB与无水乙醇形成白色沉淀后，建议置于56 ℃金属浴中加热1 min等全部透明再离心，否则会造成最后洗脱的核酸中含有一定抑制剂，再加上浓缩操作后直接影响结果；(3)核酸洗脱液中一般含有Tris-HCl等离子成分，浓缩过程中可能会造成体系中离子浓度升高，预实验发现浓缩至原体积的1/3，内标VIC曲线仍正常，也可改成稀释处理的洗脱液或者蒸馏水进行洗脱，减少后顾之忧；(4)不浓缩但是降低洗脱液体积也是可选项，但可能会导致洗脱不充分，降低洗脱率。

本实验所用的试剂盒是同类型结核分枝杆菌检测试剂盒中少见的含有内标的试剂盒，该内标是指外加的含内标基因片段的克隆质粒，内标片段长97 bp，与本组检测的目的基因长度相似(116 bp)，优势在于可以评估PCR反应是否正常以及是否有效，减少由于PCR反应异常导致的假阴性。但本实验仍有一些不足之处，反应体系不包含组织内参基因，无法严格反映所提取样本的质量，例如检测脱钙的标本结果阴性，不排除核酸遭到严重破环从而导致无法检出的原因。因此，对于核酸浓度极低或者OD260/280比值异常的病例，需谨慎评估。