2020—2021年关岭牛犊牛源大肠杆菌的分离鉴定和耐药性检测

徐 雨，冯明祥，韦登雄，图 雅，陈 颖，刘 苹，陈永翠，田 爽

(贵州省关岭布依族苗族自治县动物疫病预防控制中心，贵州 关岭 561300)

大肠杆菌又名大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)，是人和动物肠道中的共生菌和条件致病菌[1]。犊牛大肠杆菌病是牛的常见高发病，由致病性大肠杆菌引起。感染犊牛出现消瘦、腹泻、脱水，甚至死亡，呈地方流行性和散发性，多发于10日龄以内犊牛，常与其他病原混合感染或继发感染[2，3]。该病通常使用抗菌药物治疗，然而抗菌药物的不合理使用和滥用导致细菌耐药性不断增强[4，5]。本研究通过从关岭牛养殖场(户)有腹泻症状的犊牛粪便中分离出大肠杆菌并进行耐药性检测分析，以期为关岭牛养殖的科学合理用药提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 检测样品2020年7月—2021年10月，在贵州省关岭布依族苗族自治县无菌采集20个关岭牛养殖场(户)有腹泻症状的犊牛粪便41份作为检测样品。

1.2 主要试剂(1)伊红美蓝琼脂培养基(批号：20210326-00)、麦康凯琼脂培养基(批号：20200716-00)、普通营养琼脂培养基(批号：20201209-00)、肠杆菌科生化试管(批号：20200612)、13种药敏纸片，均购自杭州微生物试剂有限公司。(2)0.5号麦氏比浊管(bio-kont)，购自温州康泰生物科技有限公司。

1.3 主要仪器温培养箱(型号：PYX-DHS-35X40S，上海跃进医疗器械厂)、立式高压蒸汽灭菌器(型号：LDZX-50KBS，上海申安医疗器械厂)、电子天平(型号：JY5002，上海衡平仪器仪表厂)、生物安全柜(型号：HR30-IIA2，青岛海尔特种电器有限公司)、移液器[赛默飞世尔科技(中国)有限公司)]。

1.4 细菌分离培养将采集的粪便无菌划线接种于麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基，37 ℃培养 24 h，观察菌落生长情况。挑取单个菌落接种于普通营养琼脂培养基，37 ℃ 纯化培养24 h，备用。

1.5 革兰氏染色镜检挑取纯化培养的菌落进行涂片，革兰氏染色，光学显微镜检查。

1.6 生化试验将纯化培养菌落分别接种于11种肠杆菌科生化试管中，37 ℃培养24 h，根据生化管说明书判定结果。

1.7 药敏试验分别挑取单个菌落用灭菌生理盐水制成0.5麦氏单位菌(约1.5×108个细菌/mL)，滴加菌液0.35 mL至普通营养琼脂培养基，用涂抹棒涂抹均匀，待干后，取含有13种常用抗大肠杆菌药物的药敏纸片贴于营养琼脂表面，37 ℃培养 18 h，测量抑菌圈直径(重复3次)。

1.8 基因测序将13株分离菌(生化试验和药敏试验结果均一致的菌株只取1株)送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因测序(通用引物：16S rDNA 27F/149R)，将测序结果在BLAST官网进行比对分析，并与GenBank(基因库)中3株大肠杆菌(登录号：NR_027549、NR_074902、NR_114079)进行基因序列比对分析。

2 结果

2.1 菌落特征在13个养殖场(户)的粪便样品中分离培养出24株疑似大肠杆菌的菌落。在麦康凯琼脂培养基中菌落为圆形、表面光滑、粉红色；伊红美蓝琼脂培养基中菌落为圆形、表明光滑、有金属光泽、深紫黑色；普通营养琼脂培养基中菌落为圆形、表面光滑、半透明、灰白色。见图1。

伊红美蓝琼脂培养基

2.2 细菌特征革兰氏染色镜检，细菌为短杆状、两端钝圆的革兰氏阴性菌(红色)。见图2。

图2 分离菌革兰氏染色镜检(10×100)

2.3 生化特性24株分离菌的靛基质、甲基红、运动力、产气、山梨醇、木糖试验为阳性，V-P、硫化氢、苯丙氨酸、枸橼酸盐、尿素酶试验为阴性。根据肠杆菌科细菌编码册初步鉴定为大肠杆菌。

2.4 耐药性24株分离菌均有耐药性，其中对多西环素的耐药率最高为75%，对诺氟沙星的耐药率最低为25%，对四环素、复方新诺明、环丙沙星、头孢噻吩、氨苄西林、磺胺异噁唑、阿莫西林的耐药率均超过50%(见表1)。24株分离株均有多重耐药性，最少对2种药物耐药，最多对13种药物均耐药(见图3)。

表1 药敏试验结果

图3 分离菌株耐药性

2.5 基因测序比对选取的13株分离菌基因测序结果通过BLAST比对分析，与大肠杆菌同源性均达到99%以上。将13株细菌与GenBank中3株大肠杆菌进行多序列比对，一致率为99.33%，最终鉴定均为大肠杆菌。见图4。

图4 分离菌基因序列比对

3 结论

通过采集关岭牛腹泻犊牛的粪便进行细菌培养鉴定，最终分离出24株大肠杆菌。分离的大肠杆菌均对2种以上抗菌药有耐药性，其中对多西环素的耐药率最高为75%，对诺氟沙星的耐药率最低为25%。

4 讨论

4.1多年来，由于许多养殖场(户)对兽用抗菌药的不合理使用或滥用，使得细菌耐药性不断增强并且复杂化，给畜牧业健康发展带来极大的隐患[3，6]。本次检测的18、19、20号菌株为同1个养殖场分离的大肠杆菌，对13种药物全部耐药，而另1个养殖场分离的6、7、8号菌株中，只有1株对2种药物敏感，其余2株也是全部耐药。这2个场都是饲养多年的规模化养殖场，需要高度重视耐药性的危害，并制定合理的用药制度和规程，否则一旦发病很难控制，将造成严重损失。

4.2对于细菌耐药性较高的养殖场，建议加强清洁卫生和消毒，积极采取以预防为主的防疫措施。发生疾病时应及时请兽医防疫部门进行检测诊断，根据诊断和药敏试验结果针对性用药，不要盲目私自用药，特别要谨慎联合大剂量使用抗菌药物。同时对耐药性高的养殖场要进行定期监测，防止耐药性进一步增强。