不同输精密度对湖羊胚胎移植供体冲胚效果的影响

高 峰，李心海*，王 岩

(1.徐州生物工程职业技术学院，江苏 徐州 221000；2.江苏汉羊牧业生态科技有限公司，江苏 徐州 221000)

湖羊是我国一级保护地方家畜品种，主要养殖于江浙地区，具有早熟、一年四季均可发情、普遍每胎多羔、泌乳性能优良、生长发育快、耐热耐湿等优良性状，且肉质细腻，裘皮(尤其是羔羊皮)质地柔软、花纹优美，深受消费者的欢迎，是1种适宜广泛舍饲的优良绵羊品种[1～5]。近年来，羊腹腔镜输精技术已在生产中广泛推广应用，尤其在引种和扩繁等方面发挥着重要作用。为了进一步利用新技术提高湖羊的繁殖率，本试验采用不同输精密度对湖羊胚胎移植供体冲胚效果进行比较，以期为湖羊繁殖技术的改良提供基础参考数据，加快湖羊繁殖新技术的推广。

1 材料与方法

1.1 试验动物试验湖羊选择1～2年龄、体重50 kg 左右、膘情良好、无生殖系统疾病的经产母羊50只，作为胚胎移植供体；选择体格健壮、性欲旺盛、体重60 kg左右、无生殖系统疾病的公羊5只，作为精液供种羊。试验前B超检查(15 d后再检查1次)确定母羊未怀孕，母羊与公羊严格隔离饲养。

1.2 药品与仪器(1)羊专用阴道硅橡胶孕酮栓(CIDR，南非ZOETIS公司生产，规格：20支/包，0.3 g 孕酮/支)、兽用孕马血清(PMSG，宁波三生生物科技有限公司生产，规格：1 000 IU/瓶，批号：110914564)、氯前列烯醇(PGF2α，宁波三生生物科技有限公司生产，规格：2 mL∶0.2 mg/瓶，批号：110912207)、促卵泡素(FSH，宁波第二激素厂，规格：100 IU/瓶，批号110254629)，4 ℃保存。(2)主要仪器：冲胚管、母羊保定台、恒温水浴锅、腹腔镜、体视显微镜、开膣器、子宫钳、集精杯、手术剪、医用喷壶、止血钳、注射器、液氮罐、培养皿、手术刀片、手术架、医用缝合线、留置针、镊子等。

1.3 饲养管理精饲料为全价颗粒料，粗饲料为苜蓿、花生秧、秸秆等青贮饲料。每天8：00、17：00各饲喂1次，自由采食，自动饮水器自由饮水。种公羊加饲胡萝卜和鸡蛋。

1.4 试验方法及分组试验时间：2021年10—11月。地点：江苏汉羊牧业生态科技有限公司养殖基地。试验母羊均先进行同期发情和超数排卵处理(处理过程中不分组)。

1.4.1 同期发情与超数排卵采用CIDR+PMSG+PGF2α+FSH法进行同期发情和超数排卵处理。埋栓(CIDR)当天标记为第1 d，均埋栓13 d。第11 d下午肌注FSH，每隔12 h注射1次，连续注射7次，剂量逐渐递减(100、70、70、60、40、30、30 IU/只)，FSH总剂量为400 IU/只。第13 d下午注射FSH的同时，肌肉注射PMSG 200 IU/只，第14 d上午取栓的同时肌肉注射PGF2α 0.1 mg/只。

1.4.2 分组及输精经过同期发情和超数排卵处理的发情母羊随机分为5组，分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、IV、V组，每组10只。撤栓48 h后进行腹腔镜子宫角输精。每组分别输入不同精子密度的鲜精：Ⅰ 组为2×108个/mL，Ⅱ 组为3×108个/mL，Ⅲ组为4×108个/mL，IV组为5×108个/mL，V组为6×108个/mL)。每只母羊输入精液0.2 mL(精子活力0.9)。

1.4.3 腹腔镜子宫角输精方法穿刺部位选择在母羊乳头下方14 cm左右处，腹中线两侧各穿刺1孔(见图1)[6～7]。在左侧乳头下方14 cm左右、偏离腹中线左侧3～4 cm 处插入0.7 cm的套管针，刺穿皮肤深度2 cm，将套管送入腹腔(注意不要将套管针头刺入太深，以免刺穿内脏)。通过套管向腹腔内部充入适量空气，以压迫内脏向前，暴露卵巢和子宫角。通过套管向腹腔插入带有冷光源的内窥镜，观察卵巢上的排卵点和红体状态及数量。此时在右侧相同位置处插入套管针，拔针后通过套管插入输精枪，用输精枪轻轻挑起卵巢，以便观察排卵点和红体。如果卵巢上有多个红体和排卵点时即可输精，若没有排卵点和红体则不必输精。找到子宫角分叉处，在一侧子宫角距离分叉1/3 处，用输精枪前端针头刺入子宫角内，感觉到有阻力时，缓慢注射1/2精液量，然后拔出针头，将剩余精液注入到另一侧子宫角相应位置，完成输精。腹腔镜输精过程中的注意事项：(1)手术过程中母羊头颈部弯曲程度不能过大，防止气管不通畅。输精操作后30 min左右母羊会逐渐苏醒，若未醒可注射鹿醒灵0.2 mL解除麻醉。(2)用输精枪寻找卵巢和子宫角时动作要轻。若操作不当，输精枪针头很容易刺破子宫附近的血管造成大出血。可以采用没有针头的输精枪或长钳先进行寻找，然后再输精。输精枪针头不要触碰卵巢，以免刺破卵泡。(3)输精枪输精位置要选择靠近子宫角基部1/3处，最好在子宫角中线处。不要选择在子宫角皱褶处，容易造成脱针。(4)输精时要依靠手腕摆动的力量将针头完全扎入子宫角内，手臂不能动，以免动作过大造成其他不必要的损伤。输精时动作要与羊腹部运动一致，以免惊扰母羊。(5)输精过程中要随时观察输精位置有无精液外流。如有外流说明输入不顺畅，可能扎到皱褶中或子宫角壁上，可以拔出后重新输入。腹腔镜输精手法需要多次操练，熟练掌握后几分钟即可完成输精操作。实际操作中也可以将子宫角取出体外，在相应位置进行输精(腹腔外输精操作难度较小，但是子宫角暴露在外，开口相对较大，对母羊损伤较大)。输精完成后用生理盐水冲洗子宫角，向腹腔导入消炎药(如：头孢曲松钠1 g)，防止发炎和子宫粘连，最后采用可吸收线2层缝合，将腹膜、肌肉一起缝合，皮肤单独缝合。缝合后连续 3 d肌肉注射消炎药物(如：头孢曲松钠1 g/次，2次/d)。输精后可以少量饮水，12 h后饲喂营养丰富的日粮，密切观察母羊状态和伤口，避免刺激。

1、2为穿刺部位

1.4.4 胚胎的采集输精后第6 d采集胚胎。手术前对供体母羊肌肉注射陆眠宁1 mL/只，然后在靠近乳房的腹部作一纵行切口，用食指和中指夹住子宫角并拉出腹腔外，用生理盐水冲洗一下，用灭菌的回形针刺破子宫角壁，并从此处插入套管针，将针芯抽出，再用回形针刺破子宫角另一端，并在此处插入冲胚管。用注射器向冲胚管内注入适量生理盐水，能够将子宫角撑开，但不能将子宫角壁撑破，在冲胚管的另一端用集卵皿收集胚胎。用注射器吸取生理盐水注入套管进行冲胚，并在冲胚管的末端收集冲胚液，最后用注射器将水囊(冲胚管中的附属结构)的水抽完，从子宫角抽出冲胚管，冲洗子宫并放回腹腔，缝合腹壁。手术完成后肌肉注射陆醒宁1 mL，连续3 d肌肉注射消炎药物(头孢曲松钠1 g/次，2次/d)。

1.4.5 检胚将冲胚液静置10 min，在室温下用体视显微镜(×20)检查胚胎是否合格。先用吸管吸取上清液并弃掉，再用吸管将胚胎转移至另一培养皿中，反复寻找胚胎(包括未受精卵)，将所有胚胎和未受精卵检出。

1.4.6 数据统计冲胚数包括未受精卵和受精卵形成胚胎的总数。卵子受精率=受精胚胎数÷冲胚数×100%。可用胚胎率=可用胚胎÷受精胚胎数×100%。用Excel 2003统计试验数据，用软件SAS 2019 PROCFREQ进行差异显著性分析。

2 结果与分析

由表1可见：不同输精密度对供体母羊腹腔镜子宫角输精后的冲胚结果有一定影响。冲胚数最高为Ⅴ组(137枚)，最低为Ⅲ组(127枚)；受精胚胎数最高为Ⅴ组(128枚)，最低为 Ⅰ 组(110枚)；卵子受精率最高为Ⅴ组(93.43%)，最低为 Ⅰ 组(85.27%)。受精胚胎中可用胚胎数最高为Ⅴ组(110枚)，最低为 Ⅰ 组(83枚)；可用胚胎率最高为Ⅴ组(86.62%)，最低为 Ⅰ 组(75.45%)。Ⅰ组的卵子受精率和可用胚胎率均显著低于其他各组(P<0.05)，但其余各组之间差异不显著(P>0.05)。正常发育的胚胎见图2。

表1 不同输精密度供体母羊冲胚统计

图2 正常发育的胚胎(×20)

3 结论

通过比较不同精液密度对湖羊腹腔镜子宫角输精的效果，最低有效输精密度为3×108个/mL(有效精子数0.6亿个)，输精量为每只母羊0.2 mL。

4 讨论

4.1近年来，羊的腹腔镜输精技术得到了快速发展，而精液品质的好坏是关系到此项技术是否能推广的关键。精液密度是精液质量的重要评价指标之一，确定最优输精密度是推广腹腔镜输精技术、提高卵子受精率和良种精液利用率的关键。绵羊的精液密度为20～30亿个/mL。每次采精1.5 mL左右。目前大多数养殖场采用阴道人工授精(3～4倍稀释)，每只母羊输入精液0.2 mL，这在一定程度上造成了优质精液的浪费，且阴道人工授精效果有限。本试验结果表明：腹腔镜子宫角输精可将精液稀释7～10倍(精子密度3×108个/mL)，每只母羊输入0.2 mL，母羊的卵子受精率可达91.67%，可用胚胎率达85.95%，明显优于阴道输精。这与苏和、毛凤显、魏玉刚、许文海等对羊的相关研究结果基本一致[8～11]。

4.2配种过程中输精密度过低会导致卵子受精率下降；精液密度过高不仅浪费优质精液资源，还会造成精子生存环境恶化，精液品质降低。本研究通过比较不同精液密度对湖羊腹腔镜子宫角输精效果，在胚胎移植过程中，湖羊输精的最低有效密度可以设置为3×108个/mL，从而提高优良种公羊的利用率，降低种公羊的饲养规模，节约饲养成本，给羊场带来更大的经济效益。高于此输精密度对于母羊的卵子受精率和可用胚胎率并没有明显提高，反而造成精液浪费；低于此密度则会造成卵子受精率下降，不利于繁殖育种。