苦荞全基因组SSR位点鉴定及分子标记开发

蔡齐宗，王佳蕊，陈庆富，李洪有,2

(1.贵州师范大学荞麦产业技术研究中心，贵州 贵阳,550001；2.贵州大学山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室，贵州 贵阳，550025)

苦荞(Fagopyrmtataricum(L.) Gaertn.)属于蓼科荞麦属1 a生药食同源小杂粮作物，起源于中国西南部，具有耐贫瘠、抗旱、耐冷凉、适应性强、生育期短等特点[1-3]。苦荞作为一种重要的药食同源小杂粮作物，不仅含有丰富的营养物质(蛋白质、氨基酸、脂肪、膳食纤维、维生素、各类矿质元素等)，还富含生物活性黄酮类化合物，具有消炎、抗氧化、抗动脉硬化、降“三高”、防糖尿病、防癌抗癌等多种医药保健功能，享有“五谷杂粮之王”和“三降”食品的美誉[3-7]。目前，苦荞因其优异的保健作用，备受人们青睐。

中国作为苦荞的起源地和栽培历史最为悠久的国家，已有4 000多年的栽培历史，具有极其丰富的苦荞种质资源[3-6,8-9]。因此，基于分子标记开展苦荞种质资源遗传多样性、重要农艺性状控制基因的遗传定位、遗传图谱构建等研究，对苦荞新品种选育、产业发展具有重要意义。

SSR(simple sequence repeats，简单重复序列)，也称微卫星DNA(microsatellites DNA)，是一类由1～6个核苷酸为基本重复单元并在基因组中多次串联重复的一段DNA序列[10-13]。由于SSR分子标记具有数量多、多态性高、共显性、使用成本低及操作简便等特点，已广泛应用于植物遗传图谱构建、遗传多样性分析、基因定位与克隆、数量性状基因座(quantitative trait locus，QTL)定位等方面，是目前最为常用的分子标记之一[10-16]。目前，在苦荞中已有SSR位点鉴定及分子标记开发的相关报道。黎瑞源等[12]基于苦荞种子转录组数据共鉴定到2 700个SSR位点，设计合成150对SSR引物，并发现其中30对引物在40份苦荞种质中具有多态性。贺润丽等[13]从苦荞种皮转录组数据中共鉴定到9 094个SSR位点，并设计了53对SSR引物，发现21对引物在苦荞种质中具有多态性。杜伟等[11]从苦荞全长转录组数据中共鉴定到1 107个SSR位点，并设计了132对SSR引物，其中11对具有较好的多态性且能将123份苦荞种质划分为2个亚群。此外，随着苦荞全基因组测序完成，基于苦荞全基因组序列的SSR位点鉴定及分子标记开发也被开展起来。马名川等[10]在苦荞基因组中共检测到1 640个SSR 位点，并设计出479对SSR引物，在选择的200对引物中有56对在苦荞和甜荞种质中扩增出多态性。FANG等[14]在苦荞基因组中鉴定到37 572个SSR位点，SSR位点出现频率为12.32个·kb-1。此外，FANG等[14]还设计出26 549对SSR引物，平均每17 kb有1个SSR标记。虽然目前已有大量的SSR标记在苦荞中被鉴定，但考虑到在其他多种植物的基因组中SSR位点发生频率为2～5个·kb-1[16-24]，因此推测目前苦荞基因组中鉴定的SSR位点并未达到饱和。因此，本研究在已有的苦荞全基因组序列的基础上，对苦荞基因组中的SSR位点进行系统鉴定并分析SSR特征，得到数目众多的SSR位点，据此开发出大量SSR标记并进行多态性验证，为苦荞遗传多样性分析、高密度遗传图谱构建、重要基因定位与克隆、种质资源保护及遗传改良等研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取10份种子表型具有明显差异的苦荞种质作为SSR引物多态性鉴定的材料(表1)。所有研究材料由贵州师范大学荞麦产业技术研究中心提供。

表1 供试苦荞材料及其种子农艺性状Table 1 Tartary buckwheat accessions used in this study and their seed traits

1.2 DNA样品制备

将10份苦荞种质各取15粒成熟种子，放置于已用酒精消毒过的垫有发芽纸的发芽盒中，均匀摆放，用小型喷壶将纸面打湿且盒内处于无积水状态，盖上发芽盒盒盖，将其置于光照培养箱中进行发芽培育。培养条件为温度25 ℃，光照和黑暗各12 h。每天定时补水1次。待种子长出2片子叶后，采集样品3株，随后利用研磨机磨样，采用CTAB法提取DNA[25]，采用质量分数1%琼脂糖凝胶电泳法初步检查DNA的大小和质量，用微量紫外浓度检测仪检测DNA的质量浓度，根据A260和A280处吸光度的比值检测DNA质量，于-20 ℃保存。

1.3 苦荞基因组序列下载及SSR搜索方法

苦荞“品苦1号”基因组序列下载自MBKbase数据库(http://www.mbkbase.org/Pinku1/)，其基因组大小为451.36 Mb。利用MISA1.0 对苦荞全基因组序列进行SSR位点搜索。SSR位点筛选标准为：(1)1、2、3、4、5、6 个碱基的最低重复次数分别为10、6、5、5、5、5；(2)2 个SSR 位点之间的最小距离为100 bp。

1.4 SSR引物设计及多态性检测

根据鉴定的苦荞全基因组SSR 位点侧翼的保守序列，利用Primer 3.0(Linux版)进行引物批量设计。设计的引物长度为18～23 bp，退火温度为50～65 ℃，GC含量(DNA的4种碱基中，鸟嘌呤G和胞嘧啶C占全部碱基的比例)为45%～60%，扩增产物长度为100～300 bp。

随机选取50对设计的引物送上海生物工程股份有限公司进行引物合成，以提取的10份苦荞种质DNA为模板进行 PCR 扩增。PCR 反应体系：共10 μL，包括1μL(0.05 g·L-1)基因组DNA，6 μL 2×PCR Mix(vazyme)，1 μL(2 μmol·L-1)上游引物、1μL(2 μmol·L-1)上下游引物和1 μL ddH2O。PCR 扩增反应程序：94 ℃预变性 5min；94 ℃变性 40 s，53～57 ℃退火40 s，72 ℃延伸 40 s，33个循环；最后72 ℃延伸 5 min，反应结束后将PCR管置于沸水中变性5 min，最后产物中加入6 μL loading buffer进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳：采用质量分数为 6%的非变性聚丙烯酰胺进行凝胶电泳。电泳条件是：0.5×TBE缓冲液，300～500 V电压，约100 mA电流，电泳时间为0.5～1.5 h，直到Marker及目的条带扩散开且未跑出，取出凝胶后用银染法染色，最后将其置于凝胶成像仪上拍照。

1.5 统计方法

使用EXCEL 2016对获得的数据进行统计分析和作图。根据10份苦荞种质做聚丙烯酰胺凝胶电泳得到的电泳图谱，将有显著清晰的条带记为1，将无差异条带或无法明显分辨的弱带记为0，同时，缺失条带记为999，最后构建数据矩阵，并根据类平均法( UPG-MA，unweighted pair group method arithmetic averages) ，使用 NTSYS-pc 2.20软件对10份苦荞种质做聚类分析[26]。

2 结果与分析

2.1 苦荞全基因组SSR鉴定及其在染色体的分布

利用MISA1.0 软件在苦荞全基因组序列中共鉴定到148 830个SSR位点，平均每3.04 kb就有一个SSR位点。鉴定的SSR位点分布在苦荞所有8条染色体上，各染色体上的SSR位点个数从高到低依次为1号染色体(22 521个)、2号染色体(19 763个)、3号染色体(19 479个)、4号染色体(18 374个)、5号染色体(17 549个)、6号染色体(17 171个)、7号染色体(17 161个)、8号染色体(16 812个)。各条染色体上SSR分布频数密度从高到低依次为3号染色体(0.338个·kb-1)、8号染色体(0.336个·kb-1)、7号染色体(0.333个·kb-1)、1号染色体(0.331个·kb-1)、6号染色体(0.328个·kb-1)、5号染色体(0.326个·kb-1)、4号染色(0.324个·kb-1)、2号染色体(0.323个·kb-1)。单核苷酸至六核苷酸SSR重复类型均存在于苦荞基因组中(表2)，但各类型SSR出现频率差异较大。各类型SSR出现的频率从高到低依次为单核苷酸重复(55.13%)、二核苷酸重复(34.97%)、三核苷酸重复(7.86%)、四核苷酸重复(1.52%)、五核苷酸重复(0.37%)、六核苷酸重复(0.15%)。在6种SSR重复类型中，单核苷酸重复和双核苷酸重复占总数目的90.10%(表3)。

表2 各类型SSR在苦荞染色体上的分布情况Table 2 Distribution of various types of SSR markers on tartary buckwheat chromosomes

2.2 苦荞不同类型SSR的重复频率及分布特征

SSR分子标记重复类型共96种。表3显示了从单核苷酸重复频率到六核苷酸重复频率的分布状况和数量特征。在每种重复基序类型中，重复频率越少其数量越多，5～11次重复的基因序列共有100 547个，所占比例为67.56%。单核苷酸基序中，重复10次的最多(40 001，占48.75%)；二核苷酸中，6次重复的最多(11 734个，占22.55%)；三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸基序中，5次重复的最多。在96种重复频率中，单核苷酸重复类型中重复频率为10次的是所有重复类型中最多的。

表3 苦荞各SSR重复类型的重复频率Table 3 The repetition frequency and distribution of SSR loci

2.3 苦荞SSR重复基因序列类型及分布特征

SSR基序重复类型(不考虑序列互补)共发现510种。考虑序列互补时，SSR基序重复类型共有171种。在序列互补类型中，由表4可知，A/T类型最丰富，约占总SSR标记的53.143%；其次是AT/AT类型，约占总标记的30.038%，这两种类型标记占总标记的83.181%；在其余剩下的序列互补的SSR基序类型中，AAT/ATT约占总SSR的3.193%，AG/CT 约占3.083%，AAG/CTT约占2.086%，C/G占比约1.984%，AC/GT约占比1.827%，其他各类型SSR占比均不足1%。

表4 苦荞SSR基序重复类型及发生频率Table 4 SSR motif repeat typesand their frequency on tartary buckwheat

2.4 苦荞全基因组SSR引物设计及多态性评价

根据检测到的148 830个SSR位点，利用Primer 3.0进行引物设计，共批量设计出128 706对引物。

为了验证设计的引物是否有效，随机选取50对引物对10份具有不同性状的苦荞种质进行多态性检测。在50对引物中，41对引物(82.00%)有明显的扩增条带，其中15对引物的扩增条带表现出明显的多态性，多态率为30.00%,18号引物具有多态性，但不明显(图1)，有效引物序列信息见表5。

根据15对引物扩增多态性结果，利用种质间的遗传相似性系数对10份苦荞进行聚类分析，结果表明,当遗传相似相系数为0.63时，10份苦荞可聚类为4个类群，其中类群Ⅰ仅含T5，种子性状为黑色圆粒厚壳；类群Ⅱ包含T3、T6、T7、T9，T3、T6、T9都是厚壳；T3、T6、T7种皮均为黑色；类群Ⅲ包含T8、T10，种子均是锥形；类群Ⅳ包含T1、T2、T4，种子都较短(图2)。

注：图中M1和M2表示marker;上方1～10表示10份苦荞种质;下方数字表示引物序号。Note:M1 and M2 in the figure represent markers;The number inthe top markered as 1-10 represent 10 tartary buckwheat germplasms;The bottom numbers represent primer numbers.图1 引物 (下方)在10个苦荞种质(上方)中的扩增产物多态性Fig.1 The polymorphism of SSR primers (Bottom) among 10 tartary buckwheat germplasms (Top)

图2 10份苦荞种质聚类分析Fig.2 Cluster analysis of 10 tartary buckwheat accessions

3 结论与讨论

目前已有一些关于苦荞SSR开发的报道，这些报道中发现的SSR位点数的范围为7 147～37 572[10-14,27-30]，SSR标记远未达到饱和。本研究以苦荞全基因组序列(总长度451 363 871 bp)为基础，利用MISA1.0软件共鉴定到148 830个SSR位点，它们在8条染色体上均有分布。本研究鉴定的SSR位点的发生频率为3.04个·kb-1，其数目是目前苦荞中鉴定到的最多SSR位点数目(37 572个)的近4倍[10,14]。因此，本研究所得到的SSR位点更加全面和丰富，其原因可能与本研究中SSR筛选时设置标准更精细有关。此外，在许多植物全基因组序列中，SSR位点发生的频率主要集中在2～5个·kb-1[16-24]。因此，推测本研究在苦荞全基因组上鉴定的SSR位点基本达到了饱和。

本研究鉴定的苦荞SSR可分为单核苷酸重复至六核苷酸重复6种类型，其中单核苷酸重复和二核苷酸重复是主要的SSR类型，二者所占比例分别高达55.13%和34.97%。这些研究结果与其他已报道[10-14,27-30]的结果间存在一定的差异。同转录组序列来源的SSR类型相比[11-13]，优势类型一致，均为单核苷酸重复，但转录组数据中的第二大SSR类型为三核苷酸重复；同基因组序列来源的SSR类型相比，优势类型不一致，本研究鉴定的优势SSR类型为单核苷酸重复和二核苷酸重复，而FANG等[14]鉴定的SSR优势类型为二核苷酸重复和三核苷酸重复，马名川等[10]鉴定的优势类型为三核苷酸重复和二核苷酸重复。这些差异可能是由于前人用于SSR位点查询的核酸序列大小或者鉴定方法与本研究不一致导致其SSR位点鉴定不够全面所致；与转录组测序所得到的SSR位点相比，全基因组分析更加全面。本研究中，从SSR位点重复基序类型来看，A/T重复类型最丰富，约占总SSR标记的53.143%，其次是AT/AT重复类型，约占总标记的30.038%。这些结果与前人[10,15,27-30]的在苦荞中鉴定的优势基序类型基本一致，表明苦荞中的SSR位点的优势基序类型是A/T和AT/AT重复类型。

在苦荞SSR引物多态性研究方面，FANG等[14]对440对SSR引物进行PCR扩增，其中313对(79.44%)具有多态性；马名川等[10]研究从200对引物中获得了17对具有多态性(0.85%)的引物；贺润丽等[13]研究中使用53对引物进行PCR扩增，其中21对扩增出了多态性(51.22%)；SHI等[30]研究中，150对引物中有36对引物具有多态性(24%)。本研究使用Primer 3.0共设计出128 706对SSR引物，验证结果显示多态率为30.00%，因此，设计的SSR引物是可靠的，可用于苦荞分类、遗传定位等研究。

综上所述，本研究从451.36 Mb的苦荞全基因组序列中鉴定出148 830个SSR位点，平均每隔3.04 kb就有一个SSR位点。单核苷酸重复和二核苷酸重复类型最为丰富。在获得的SSR序列中，共鉴定出171种碱基重复类型，表明苦荞基因组SSR序列类型较为丰富。此外，本研究共设计出128 706对SSR引物，并对其中50对SSR引物的多态性进行验证，获得15对多态性好的SSR引物，平均多态性为30%，表明这些设计的引物可以用于苦荞相关研究。