类风湿性关节炎药理实验模型的研究进展

陆丹丹韩晓燕张 晗李 霖∗房士明∗

(1.天津中医药大学,方剂学教育部重点实验室,天津 301617;2.天津中医药大学,中药学院 天津 301617)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以滑膜炎症为基本病理改变的自身免疫病,中医认为“风、寒、湿三气杂至,合而为痹”,并根据疾病特点将RA 归属于“痹症”“尪痹”等范畴,在《内经》、《素问·痹论篇》等书中均有记载[1]。 据统计,RA 影响全球约0.1%~2.0%的人口,在中国类风湿关节炎的患病率约为0.42%,其中心血管合并症患病率为1.5%[2-3]。 类风湿性关节炎临床表现为手腕等小关节对称性、持续性活动受限且疼痛肿胀,发病与气候、遗传、免疫及肠道菌群失衡具有相关性[4]。

现代研究认为RA 发病过程主要包括炎性细胞浸润滑膜,造成滑膜增生并在滑膜腔中形成血管翳,最终使关节软骨和骨质破坏[5]。 大量文献研究表明类风湿关节炎与免疫T 细胞及B 细胞亚群的聚集、促炎因子、趋化因子活化和表达等相关,但其深入确切的发病机理尚不完全明确[6]。 中医认为RA 病机复杂,多与湿、热、瘀血等证紧密联系[7]。

本文根据现代医学理论和传统中医辨证论治原则,从类风湿关节炎发病机制出发,分析几种关节炎实验模型,同时综述肠道菌群与RA 的关系,希望能为类风湿研究选择合适的模型提供参考。

1 诱导性RA 动物模型

在诱导模型中,非特异性免疫激活,软骨定向自身免疫或大量的外源、感染性诱因会引起类似RA 样疾病,目前使用较多的该模型有胶原诱导关节炎、佐剂性关节炎模型。

1.1 胶原诱导的关节炎( collagen-induced arthritis, CIA)模型

CIA 是主动免疫诱导RA 的经典模型。 Ⅱ型胶原(collagen Ⅱ, CⅡ)乳剂制备方法是在4℃条件下将Ⅱ型胶原溶于乙酸,灭活卡介苗置于液体石蜡中配成弗氏完全佐剂(complete freund’ s adjuvant,CFA)。 将二者等体积混合乳化至滴水不溶状态,制成CII 乳剂[8]。

小鼠(例如DBA/1J 品系)造模方法是将50 μL含2 mg/mL 牛Ⅱ型胶原的CII 乳剂在尾根部皮内注射诱发关节炎,于18 d 后用含有弗氏不完全佐剂(incomplete freund’s adjuvant, IFA)的CII 乳剂同法注射加强免疫[9]。 小鼠CIA 模型病变情况可由关节肿胀度测量,关节炎评分和关节病理变化确定[10]。 小鼠关节肿胀度和关节炎评分增加,关节组织中出现炎性细胞浸润、滑膜增厚等可提示造模成功[11]。 此模型可用于RA 新药物预防、治疗作用检测和细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α)等治疗靶点的检测[12]。 有研究发现DBA/1 小鼠中CIA 的严重程度和发病率可以通过CII 与CFA,IFA 和LPS的组合变化来控制,结果显示使用LPS 可以增加关节炎严重程度[13]。

大鼠CIA 模型的制备方法是在距离大鼠尾根部4 cm 处皮下注射CII 乳剂(1 mg/mL)200 μL,注射后按压针孔防止乳液流出,于7 d 后采用同样方法在距离尾根2 cm 处皮下注射CII 乳剂100 μL。若大鼠炎症评分、关节肿胀度均显著增高,痛域显著降低则提示造模成功[14]。 CIA 所致关节炎可探究Th17/Treg(辅助性T 细胞/调节性T 细胞)失衡在RA 中的作用,但模型在疾病的发生率、同步性和分布方面存在个体差异[15]。 国外学者借助CIA 大鼠模型,通过显微计算机断层扫描技术(microcomputed tomography, Micro-CT)、骨组织学检查评估骨密度,定量ELISA 分析肌腱组织中促炎因子(TNF-α、 IL-23) 的 方 法, 得 出 英 夫 利 昔 单 抗(infliximab)可以预防关节炎相关的骨质疏松症,抑制其肌腱损伤的结论[16]。

1.2 佐剂性关节炎(adjuvant arthritis, AA)模型

AA 大鼠发病原理是诱导后的大鼠会产生针对于热休克蛋白65(heat shock protein 65, HSP65)的T 细胞和抗体反应[17]。 常选用Lewis 大鼠建立AA模型,对大鼠尾根部或足垫皮内注射0.1 mL 含有热灭活分枝杆菌(10 mg/mL)的CFA[18]。 模型制备成功的标志是大鼠自造模两周左右开始发病,炎症以踝关节为重,并累及全足,第18 天左右达到炎症高峰;在关节炎症发展过程中同时伴有毛色暗淡、易脱毛和体重减轻等表现[19]。 在大多数情况下,AA关节炎的肿胀程度不对称,其中一只足关节的发炎程度高于对侧[20]。 AA 操作方法简单,具有明显的细胞免疫异常特征,缺乏慢性病过程[21]。 Bao 等[22]利用AA 模型,蛋白质印迹和免疫组化等分析方法确定JAK/STAT 和NF-κB 信号通路中蛋白质的表达和磷酸化水平,发现芫花素(genkwanin)能够抑制AA 大鼠滑膜组织中JAK/STAT 和NF-κB 信号通路的激活。

1.3 蛋白多糖诱导的关节炎(proteoglycaninduced arthritis, PGIA)模型

在关节滑液中注射蛋白多糖抗原引发T 细胞慢性依赖性自身免疫反应,导致慢性炎症、关节破坏和轴骨受累[23]。 Horváth 等[24]选取8~12 周龄的雌性BALB/c 小鼠,将PG 核心蛋白乳化剂每隔3 周对小鼠3 次腹腔注射来完成造模。 整个实验周期较为缓慢,约需17 周完成。 小鼠初期以急性炎性水肿和滑膜炎为特征,随后表现为骨和软骨吸收,最后进展为广泛的关节强直。 此造模方法的局限所在是人类软骨必须经过广泛的加工才能制备所需的蛋白多糖组分。 Liu 等[25]用肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)阻滞剂对PGIA 中肠道菌群进行干预影响发现抗TNF-α 疗法减缓了PGIA进程,起到调节肠道菌群和肠屏障功能的作用。

1.4 链球菌细胞壁诱导的关节炎(streptococcal cell wall-induced arthritis, SCWA)模型

链球菌产生一种具有较高炎症活性的肽聚糖多糖(peptidoglycan-polysaccharide, PG-PS),可以诱导易感大小鼠形成关节炎[26]。方法是在第0、7、14和21 天,向右后足关节内注射包含细胞壁肽聚糖多糖片段的混悬液诱发单侧慢性关节炎,在第8、15 和22 天再次关节内注射激活致发炎。 第1 天和第2天为急性非T 细胞依赖期,第23~28 天为慢性T 细胞依赖期[27]。 此模型有助于研究关节炎的急性反应,但这类动物模型使用频率较低,可能是因为其使用成本和操作要求较高[28]。 Jain 等[29]利用SCWA 模型研究姜黄素- 双氯芬酸共轭物(curcumin-diclofenac conjugate, CDC)体外抗炎活性,发现其显著减轻了SCWA 模型的关节炎症状。

1.5 降植烷诱导的关节炎(proteoglycan-induced arthritis, PIA)模型

降植烷是一种非免疫原性化学物质,在DA(Dark-Agouti)大鼠尾部单次皮下注射300 μL 降植烷纯品,于50 d 后再次同法注射以诱发关节炎,每隔1 周进行如上常规检测,大鼠出现足容积增加、关节活动障碍等表现提示造模成功[30]。 该炎症为T细胞依赖型,主要用来药物验证,也可用于分析类风湿关节炎发病相关的性别差异情况。 有研究指出大鼠关节炎PIA 模型可用于模拟RA 中的血管功能障碍和脂质受损情况[31]。

1.6 抗原诱导的关节炎( antigen-induced arthritis, AIA)模型

此模型建立原理是甲基化的牛血清白蛋白(methylated bovine serum albumin, m-BSA)与免疫球蛋白G Fc 段受体(Fcγ R)结合,从而有效激活针对m-BSA 的T 细胞应答。 造模过程是将100 μg m-BSA在CFA 中1 ∶1 乳化对小鼠进行免疫,每隔1 周在颈部进行两次皮下注射m-BSA/CFA 作为加强剂量,于3 周后通过关节内注射10 μg/μL m-BSA生理盐水混悬液诱发关节炎[32]。 AIA 模型的特征是明显的T 细胞受累且不影响对侧关节。 Frey等[33]借助AIA 模型分析成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synovial cells, FLS)对慢性关节炎致病作用的分子机制,结果表明从AIA 急性期的小鼠中分离出的FLS 能够在受体中诱发炎症和关节破坏。

1.7 葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose 6-phosphate isomerase, G6PI)诱导的关节炎模型

该模型建立的发病机制是G6PI 能够在体内产生抗体,通过诱导免疫活性细胞产生细胞因子(如TNF-α、IL-1β),从而诱发关节炎。 造模方法是将400 μg 重组人G6PI 在完全弗氏佐剂中1 ∶1 乳化,并将该乳剂皮下注射于小鼠体内进行免疫[34]。 基于免疫前Treg 细胞的耗竭将自限性关节炎转变为具有明显骨破坏的不缓解性关节炎理论,有学者利用G6PI 诱导的关节炎模型进行研究发现感觉神经元的分子标志物转录激活因子3 (activating transcription factor 3, ATF-3)上调对感觉神经元有早期性和持续性影响[35]。

2 自发性基因修饰RA 动物模型

该模型建立基础是小鼠在经过一定的基因修饰后可以自发形成关节炎,该模型有利于了解类似于人类RA 的慢性病过程。

2.1 K/BxN 小鼠模型

将来自转基因K/BxN 小鼠中含有G6PI 致病性自身抗体的血清注射到C57BL/6 幼鼠诱发RA[36]。K/BxN 血清诱导的关节炎模型制备:将雄性KRN鼠与雌性NOD 鼠合笼饲养,所生的第一代小鼠即为K/BxN 小鼠。 采集2~6 月龄K/BxN 小鼠静脉血清。 将不同K/BxN 小鼠的血清混合后分别在第0天和第2 天尾静脉注射至8 周龄C57BL/6 小鼠以制备K/BxN 小鼠模型。 小鼠踝关节肿胀程度严重,且HE 染色显示关节腔隙变窄、炎症细胞浸润则提示造模成功[37]。 此模型的特点是在广泛应变背景下诱导,且关节炎发病迅速,发病率100 %,可用于研究干扰素等治疗RA 的相关机制。 Bopp 等[38]首次在K/BxN 小鼠模型中描述了颞下颌关节(temporomandibular joint, TMJ)损坏,得出了侵蚀性变化主要发生在关节软骨的浅表部分,进而导致TMJ 软骨纤维层消失的结论。

2.2 人TNF 基因(the human tumor necrosis factor gene, HTNFG)小鼠模型

通过构建人类TNF 转基因小鼠,表现出人类TNF 基因表达的失调模式进而发展为慢性炎性多关节炎。方法是将含有3’端修饰后的完整人类TNF 基因的片段整合到CBA 与C57B1/6 杂交第2代小鼠受精卵内,待小鼠3~4 周龄时可观察到踝关节肿胀,继而9~10 周腿部运动障碍发展为完全丧失后腿的运动能力。 不同于AA、CIA 模型,TNF-α转基因小鼠能自发性出现关节炎,与人RA 的关节破坏更为相似[39]。 有学者使用该模型来确定RA炎症进展是否受到RANKL(receptor activator of NF-κB ligand, NF-κB 配体的受体激活剂)的基因失活或过表达的影响,发现RANKL 不仅可以作为破骨细胞生成和骨吸收的介质,而且可以作为影响炎症和免疫激活的疾病调节剂来调节关节炎[40]。

2.3 SKG 小鼠模型

SKG 小鼠是一种BALB/c 小鼠,其编码70×103zeta 相关蛋白(ZAP-70)Src同源2 结构域的基因发生突变,进而形成慢性自身免疫性关节炎[41]。方法是将溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS pH=7.2~7.4)溶液的甘露聚糖腹腔注射于16 周龄SKG 雌性小鼠诱发关节炎。 通过组织病理学评分发现,滑膜细胞多层次增生,关节腔内有单核细胞和中性粒细胞浸润、血管紧张素形成和富含营养的粒细胞渗出表明造模成功[42]。 Jeong 等[43]为评估酵母聚糖诱导的SKG 小鼠的临床和分子特征,利用酵母聚糖诱导的SKG 小鼠模型来反映人脊柱关节炎(spondyloarthritis, SpA)的复杂特征。

3 中医症候RA 动物模型

在RA 疾病动物模型的基础上,施加风寒湿、风湿热等外部刺激建立病证结合的RA 动物模型,或直接在痹症理论基础上建立中医动物模型以探究RA 病因病机。

3.1 AA 模型基础上的风寒湿痹模型

朱兴旺[44]通过实验表明风寒湿环境可能加重关节滑膜缺氧, 刺激缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor, HIF)表达,造成RA 滑膜细胞和新生血管生成,从而产生或加重RA 滑膜病变。 造模方法是在造模的第0 天,每只大鼠左后足跖皮内注射0.1 mL CFA,造模7 d 后再注射0.1 mL 加强免疫,建立AA 大鼠模型,并将大鼠置于5~7℃冷水中,水深2 cm,伴以3 档风力,每日1 次,每次20 min,连续14 d。 大鼠右后足垫致炎后肿胀明显,致炎后关节炎指数评分显著升高,提示造模成功[45]。

3.2 AA 模型基础上的风湿热痹模型

该模型建立的理论基础是风湿热环境可能使HSP 大量分泌,部分HSP 被瓜氨酸化进而激活免疫系统产生抗瓜氨酸抗体,从而激活或加重炎症[44]。除将大鼠置于36℃~38℃热水中,其余条件及结果观察同上述风寒湿痹模型。

3.3 风、湿、寒、热诱导的关节炎模型(wind-damp-

cold-heat induced arthritis,WDCH)

造模方法是将大鼠的后足分别在45℃和4℃的恒定温度下放入水中10 min,然后在20℃的温度下用风吹动大鼠10 min,每天2 次,共14 d。 通过血细胞分析、脾和胸腺系数、自身抗体和血清细胞因子变化对其进行评估。 大鼠滑膜中TNF-α 和血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2)表达水平升高,可表明关节炎和血管生成的发生,提示WDCH 的变化可能是RA发病的关键因素[46]。 模型的主要特点是通过外界压力来感染疾病,模拟自然环境变化。 该模型具有客观性,建模时间短,自身抗体表达水平极高和明显的组织病理学改变等优点。

4 潜在新型类风湿实验模型建立

近年来,有学者发现类风湿性关节炎作为一种粘膜疾病,有3 个部位与其有关,即肺、口腔粘膜和胃肠道[47]。 其中肠道菌群被认为是类风湿关节炎发展的重要环境因素[48],研究表明类风湿关节炎患者的肠道微生物多样性降低,与RA 持续时间和自身抗体水平相关[49]。 闫梦真等[37]通过研究发现肠道菌群失调可诱导关节组织炎性因子水平增高。 肠道营养不良可以通过影响T 细胞亚群的分化来诱发关节炎,并可能导致Th17/Treg 细胞比例失衡[50]。 有学者借助CIA 小鼠模型分析肠道微生物群及肠黏膜变化,结果发现肠道菌群失调可以影响小鼠疾病严重程度,在诱导CIA 之前微生物群的消耗可导致疾病严重程度降低约40%,诱导CIA 后期微生物消耗则导致疾病严重程度降低90%以上[51]。 肠道菌群的变化是现在研究RA 新发病机制的重要思路,未来可尝试依据肠道菌群混乱诱发建立类风湿性关节炎模型,帮助探究类风湿性关节炎相关发病机制。

5 总结

目前RA 发病机制还未完全研究清楚,临床治疗主要以控制症状,延缓关节破坏,减少并发症进而提高生活质量为目的。 因此,为更好地开发新的RA 治疗策略,需依据不同的理论和发病机制建立RA 药理模型,并根据RA 分型选用合适的动物模型。 其中CIA 模型和AA 模型应用较为广泛,在CIA、AA 基础上建立的病症结合模型在中医药基础研究中也日益受到重视。 上述几类造模方法中均以出现关节发红肿胀、关节病理改变等为主要标准,与中西医临床诊断标准中的部分内容(例如晨僵、RF 阳性等现象)有一定差别。

续表1

动物模型与临床应用的接近程度有助于RA 相关炎症及自身免疫的基础研究。 因此,动物模型特征及评价方法与中西医临床诊断标准的吻合度[52]至关重要(表1),例如吻合度较高的模型有:AA 模型、人TNF 基因小鼠模型和风寒湿痹证模型等。 其中AA 模型具有多处关节对称性肿胀、类风湿因子阳性及骨质侵蚀破坏等特征,与西医诊疗标准吻合度较高。 而风寒湿痹模型则在满足西医诊疗标准的基础上体现了中医RA 临床辨证分型,具有一定应用价值。 简化模型评价方法从而提高与临床应用的吻合度是未来动物模型发展的重要方向,如Micro-CT 技术在定量评价骨密度及骨结构等方面较为权威,且多适用于疾病的临床前研究,可作为模型评价的重要指标之一。 除此之外,肠道菌群与RA 的发生、发展及治疗有很大相关性,未来可通过矫正肠道微生物混乱来保护骨关节免受破坏,也可通过舌象与肠道微生物的联系进而建立新型动物模型来探寻治疗RA 的新策略。 然而针对中医临床症状如舌象、脉象等情况不易在动物身上被观察,为满足今后研究,还需深入研究中医证候的内涵,同时契合现代医学病因来选择和建立模型。

表1 类风湿关节炎实验模型与中西医临床病症吻合度Table 1 Coincidence between experimental model of rheumatoid arthritis and the clinical symptoms of Chinese and western medicine