柚皮素通过抑制miR-29b 的过表达对3T3-L1 脂肪细胞胰岛素抵抗的影响

王 元曾凯宏∗邓 波余雪梅周 雪宋 怡黄璐娇

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院临床营养科,成都 610072;2.电子科技大学医学院,成都 610054)

糖尿病是当代社会危害人类健康的重大疾病之一,如何有效预防糖尿病的发生和控制其发展,得到科研界广泛关注和重视[1]。 近年来研究发现,二氢黄酮类化合物柚皮素可显著降低Ⅱ型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)大鼠糖化血红蛋白和空腹血糖值,有防治T2DM 的作用[2-3],但柚皮素防治T2DM 的机制及具体分子靶点是什么? 目前还有争议,需进一步研究证实。 机体外周组织(如骨骼肌、脂肪组织等)及其细胞产生的胰岛素抵抗(insulin resistance, IR) 是T2DM 的发病机理之一[4],临床研究发现T2DM 患者血清中miR-29b 上升[5],动物实验研究发现T2DM 大鼠肝、骨骼肌和脂肪组织中miR-29b 均被上调[6],表明miR-29b 的高表达与T2DM 的发病机理相关。 因此,本文选择了3T3-L1 脂肪细胞作为研究对象,探讨柚皮素对3T3-L1 细胞的胰岛素抵抗效应的影响,并进一步探讨了miR-29b 的过表达与柚皮素在3T3-L1 细胞的胰岛素抵抗效应之间的关系。

1 材料和方法

1.1 细胞

小鼠成纤维细胞株(3T3-L1)购自于美国菌种保藏中心(ATCC)。

1.2 主要试剂与仪器

柚皮素购自于BBI Life Science 公司;miR-29b mimics、miR-29b inhibitor 购自于上海Genepharma 公司;DMEM 培养基、胎牛血清(FBS)购自于Gibco 公司;地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、胰岛素购自于Sigma 公司;磷酸缓冲液(PBS)购自于Hyclone 公司;IRS-1、GLUT4、p-Akt 购自于Abcam 公司;IgG 兔抗鼠购自于CST 公司;蛋白RIPA 裂解液、TBST 购自于Solarbio 公司;去gDNA 反转录试剂盒、iTaqTMUniversal SYBR®Green Supermix 购自于Bio-Rad 公司;脂质体Lipofectamine TM 2000 购自于Invtrogen 公司;蛋白预染marker 购自于Mercodia 公司。 PCR 扩增仪购自于Applied Biosystems;qPCR仪器型号ABI 7500 型。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养与诱导分化

将3T3-L1 前脂肪细胞接种于含10% FBS 的DMEM 中,放于37℃、5% CO2、相对湿度95%培养箱中培养。 待细胞融合2 d 后,加入含1 μmol/L 地塞米松、0.5 mmol/L IBMX、10 mg/L 胰岛素的培养液,培养48 h,然后换含10 mg/L 胰岛素的培养液继续培养,以后每48 h 换1 次培养液,至7~10 d,待细胞分化成功[7],用油红“O”染色进行鉴定,85%以上的细胞分化成为脂肪细胞。

1.3.2 胰岛素抵抗模型的建立、鉴定及实验分组

将培养液换成含10% FBS、5 mmol/L 低糖培养液培养48 h,再用无血清的低糖培养基培养12 h,最后换入含10% FBS、100 nmol/L 胰岛素的DMEM、25 mmol/L 高糖培养液,干预30 min,从而建立3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型[8],与对照组比较,模型组细胞葡萄糖摄取明显减少,说明细胞出现胰岛素抵抗,提示建模成功。

细胞分组:分别用不同浓度(0、25、50、100 μg/mL)的柚皮素干预24 h,建立如下分组:正常对照组(正常培养基培养的细胞,未干预,NC 组)、模型组(IR 模型细胞,未干预,IR 组)、溶剂模型组(IR 模型细胞+4 μL/mL DMSO,IR-V 组)、25 μg/mL 柚皮素干预IR 组(IR 模型细胞+25 μg/mL 柚皮素,IRL-Nar 组)、50 μg/mL 柚皮素干预IR 组(IR 模型细胞+50 μg/mL 柚皮素,IR-M-Nar 组)、100 μg/mL 柚皮素干预IR 组(IR 模型细胞+100 μg/mL 柚皮素,IR-H-Nar 组)。

1.3.3 细胞葡萄糖消耗检测

上述各实验组去掉培养液后,每孔加相应量含10% FBS DMEM 培养基培养2 h,按照GOD 法试剂盒说明书所述方法测定各孔内剩余葡萄糖含量,使用酶标仪在570 nm 波长处测量各孔OD 值,根据标准浓度测出的标准曲线计算各孔中葡萄糖含量,葡萄糖消耗量=空白对照组葡萄糖含量-待测组葡萄糖含量。

1.3.4 细胞转染及转染后分组

将其中miRNA-29b mimics (40 nmol/L) 和miRNA-29b inhibitor (200 nmol/L) 在50 μg/mL 柚皮素干预前加入前1 h 通过Lipofectamine TM 2000转染入3T3-L1 细胞内。

转染效率实验分组:Cell+IR 未转染组:IR;Cell+IR+miR-29b mimics 转染组:IR-miR-29b-mimic;Cell+IR+mimic 转染阴性对照组:IR-mimic-NC;Cell+IR+miR-29b inhibitor 转染组:IR-miR-29b-inhibitor;Cell+IR+inhibitor 转染阴性对照组:IR-inhibitor-NC。

柚皮素干预实验分组:Cell+普通培养液组:NC;Cell+IR 组:IR;Cell+IR+miR-29b mimics 转染组:IRmiR-29b;Cell+IR+miR-29b inhibitor 转染组:IR-antimiR-29b;Cell+IR+50 μg/mL Nar 组:IR-Nar;Cell+IR+miR-29b mimics+50 μg/mL Nar 组:IR-miR-29b-Nar;Cell+IR+miR-29b inhibitor+50 μg/mL Nar 组:IR-anti-miR-29b-Nar。

1.3.5 实时荧光定量聚合酶链式反应

分别收集各实验组中细胞,用TRIzol 试剂提取总RNA,测定GLUT4、IRS1、AKT 用TaKaRa 逆转录试剂盒进行逆转录,采用SYBR Green PCR 试剂盒进行Real-time PCR,测定miR-29b 按照MicroRNA Reverse Transcription Kit 和MicroRNA Assays 试剂盒说明书进行Real time PCR,以U6 为内参,根据qPCR 反应曲线得到各组样品目的基因和内参基因的Ct 值。 首先计算△△Ct值=(实验组目的基因的Ct平均值-实验组内参基因的Ct 平均值)-(对照组目的基因的Ct 平均值-对照组目的内参基因的Ct 平均值),则基因相对表达量为2-△△Ct。 引物序列见表1。

表1 引物序列的核苷酸序列Table 1 Nucleotide sequence of primer

1.3.6 Western blot 检测

收集各组细胞,用1% PMSF 的RIPA 细胞裂解液在冰上进行裂解细胞,离心取上清,BCA 法测定总蛋白质浓度,使用10% SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白,转印到PVDF 上,5%脱脂牛奶室温封闭1 h,加入一抗后在4℃温度下孵育过夜,TBST 洗膜3次,每次10 min,加入相应二抗室温孵育1 h,ECL 法凝胶成像系统处理,对各组条带进行计值及统计分析。

1.4 统计学方法

使用SPSS 20.0 统计软件分析处理,定量数据采用平均数±标准差(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,方差齐时采用SNK 法,方差不齐时采用Dunnett’s T3 检验,P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3T3-L1 细胞和成熟脂肪细胞的形态及鉴定

如图1A,3T3-L1 细胞呈长梭形,贴壁,不聚团生长。 如图1B 和1C,诱导3T3-L1 细胞8 d 后,可见细胞均呈现典型的脂肪细胞表型,细胞中富含脂滴,脂滴可被油红“O”染色,含脂滴细胞>85%时,大部分3T3-L1 细胞已被诱导为脂肪细胞,可用于进一步实验。

2.2 柚皮素干预对胰岛素抵抗3T3-L1 模型细胞糖代谢的影响

与正常对照组比较,模型组3T3-L1 脂肪细胞的葡萄糖消耗量显著降低(P<0.001);与模型组比较,溶剂干预模型组细胞的葡萄糖消耗量无差别,各柚皮素干预组细胞的葡萄糖消耗量均升高(P<0.01),且50 μg/mL 柚皮素干预IR 组最显著(P<0.001),其中详见表2。

表2 柚皮素对胰岛素抵抗3T3-L1 模型细胞葡萄糖摄取的影响(xˉ±s, n=3)Table 2 Effect of naringenin on glucose consumption in IR 3T3-L1 cells

2.3 柚皮素对胰岛素抵抗3T3-L1 模型细胞IRS-1/Akt/GLUT4 基因表达的影响

如图2,与正常3T3-L1 细胞未干预组相比,IR模型未干预组细胞中IRS-1、AKT、GLUT4 的mRNA表达均明显下降,其差异具有统计学意义(P<0.001)。 与IR 组比较,IR-L-Nar 组、IR-M-Nar 组、IR-H-Nar 组柚皮素干预均能促进IRS-1、Akt、GLUT4的mRNA 表达,其中IR-L-Nar 组、IR-M-Nar 组对3种基因表达增加最明显(P<0.01),即25 μg/mL 和50 μg/mL 柚皮素干预最明显(P<0.001)。 溶剂组基因的表达与IR 组比较,无差别。

2.4 柚皮素对胰岛素抵抗3T3-L1 模型细胞IRS-1/p-Akt 蛋白表达的影响

如图3A 和3B 所示,与正常培养3T3-L1 细胞相比,3T3-L1 IR 模型未干预组细胞中IRS-1、p-Akt的蛋白表达均明显下降;与IR 模型未干预组相比,柚皮素干预组IRS-1、p-Akt 的蛋白表达均增加,其中25 μg/mL 柚皮素组IRS-1 增加最明显(P<0.001),50、100 μg/mL 柚皮素组p-Akt 增加最显著(P<0.001),溶剂组蛋白的表达与模型组无差别。

注:与正常对照组相比,∗∗∗P< 0.001;与模型组相比,## P<0.01,###P<0.001。图2 柚皮素干预对3T3-L1 胰岛素抵抗模型细胞基因表达的影响Note. Compared with NC group, ∗∗∗P<0.001. Compared with IR group, ##P<0.01, ###P<0.001.Figure 2 Effect of naringenin intervention on gene expression of 3T3-L1 insulin resistance model cells

注:与正常对照组相比,∗∗∗P<0.001;与模型组相比,##P<0.01,###P<0.001。图3 各组3T3-L1 细胞蛋白表达量Note. Compared with NC group, ∗∗∗P<0.001. Compared with IR group, ##P<0.01,###P<0.001.Figure 3 Expression level of protein in 3T3-L1 cells in each group

注:A: 诱导前3T3-L1 细胞;B: 诱导成功3T3-L1 脂肪细胞;C: 3T3-L1 脂肪细胞经油红“O”染色。图1 3T3-L1 细胞的形态及鉴定Note. A, 3T3-L1 cells before induction. B, Successfully induced 3T3-L1 adipocytes. C, 3T3-L1 adipocytes were stained with oil red “O”.Figure 1 Morphology and identification of 3T3-L1 cells

2.5 对3T3-L1 细胞转染miR-29b 的鉴定

如图4 所示,与Cell+IR 未转染组相比,3T3-L1细胞被转染后Cell+IR+miR-29b mimic 组细胞的miR-29b 表达明显上升(P<0.001),Cell+IR+miR-29b-inhibitor 组miR-29b 的表达水平降低(P<0.001),Cell+IR+mimic 转染阴性对照组和Cell+IR+inhibitor 转染阴性对照组与Cell+IR 细胞未转染组miR-29b 表达一致。 此结果表明miR-375-mimic 和miR-375-inhibitor 被成功转染进入3T3-L1 IR 细胞。

注:与Cell+IR 未转染组相比,###P<0.001。图4 3T3-L1 脂肪细胞转染结果Note. Compared with IR group, ###P<0.001.Figure 4 Transfection results of 3T3-L1 adipocytes

2.6 柚皮素对3T3-L1 细胞miR-29b 上调/下调后IRS-1/Akt/GLUT4 基因表达的影响

如图5,与Cell+普通培养液组相比,Cell+IR 模型组3T3-L1 细胞中IRS-1、Akt、GLUT4 的mRNA 表达均明显下降,其差异具有统计学意义(P<0.001);Cell+IR 模型组相比,Cell+IR+miR-29b mimics 转染组3T3-L1 细胞中IRS-1、Akt、GLUT4 的mRNA 表达均降低(P<0.001),而Cell+IR+50 μg/mL Nar 组IRS-1、Akt、 GLUT4 的mRNA 表 达 均 增 加(P<0.001),Cell+IR+miR-29b mimics+50 μg/mL Nar 组IRS-1、Akt、GLUT4 的mRNA 表达均上升,且差异有统计学意义(P<0.001),Cell+IR+miR-29b inhibitor转染组和Cell+IR+miR-29b inhibitor+50 μg/mL Nar组细胞中IRS-1、Akt、GLUT4 的mRNA 表达量均无差异;与Cell+IR+50 μg/mL Nar 模型组比较,Cell+IR+miR-29b inhibitor+50 μg/mL Nar 组IRS-1、Akt、GLUT4 的mRNA 表达量下降(P<0.001)。

2.7 柚皮素对3T3-L1 细胞miR-29b 上调/下调后IRS-1/p-AKT 蛋白表达的影响

如图6A 和6B 所示,与Cell+普通培养液组相比,Cell+IR 模型组3T3-L1 细胞中IRS-1、p-Akt 的蛋白表达均明显下降(P<0.001);与Cell+IR 模型组比较,Cell+IR+miR-29b mimics 转染组3T3-L1 细胞中IRS-1、p-Akt 的蛋白表达均降低(P<0.001),Cell+IR+miR-29b inhibitor 转染组细胞中IRS-1、p-Akt的蛋白表达均无明显变化,Cell+IR+50 μg/mL Nar组IRS-1、p-Akt 的蛋白表达均增加(P<0.001),Cell+IR+miR-29b mimics+50 μg/mL Nar 组IRS-1、p-Akt的蛋白增加(P<0.001),Cell+IR+miR-29b inhibitor+50 μg/mL Nar 组IRS-1、p-Akt 的蛋白表达无变化;与Cell+IR+50 μg/mL Nar 组比较,Cell+IR+miR-29b mimics+50 μg/mL Nar 组IRS-1、p-Akt 的蛋白增加(P<0.05),Cell+IR+miR-29b inhibitor+50 μg/mL Nar 组IRS-1、p-Akt 的蛋白下降(P<0.05)。

3 讨论

柚皮素是二氢黄酮类化合物柚皮苷的苷元,研究发现膳食补充柚皮素可以显著降低链脲佐菌素(streptozocin, STZ)诱导的DM 小鼠的空腹血糖和血浆的糖化血红蛋白值,明显升高糖尿病小鼠血浆中胰岛素浓度[9],可以改善STZ 诱导的DM 小鼠的炎症反应[10]。 在3T3-L1 脂肪细胞中,柚皮素以剂量依赖方式抑制胰岛素刺激的葡萄糖摄取,从而增加脂肪细胞胰岛素抵抗发生[11]。 在本课题前期的研究中发现柚皮素干预可以提高3T3-L1 IR 细胞模型葡萄糖的摄取和胰岛素敏感性[12],但柚皮素影响3T3-L1 脂肪细胞的具体分子机制尚不清楚。

注:与Cell+普通培养液组相比,∗∗∗P<0.001;与Cell+IR 组相比,##P<0.01,###P<0.001;与Cell+IR+miR-29b mimics 转染组相比,&&&P<0.001。图5 柚皮素干预对3T3-L1 细胞转染miR-29b mimics/inhibitor 后基因表达的影响Note. Compared with NC group, ∗∗∗P<0.001. Compared with IR group, ##P<0.01, ###P<0.001. Compared with IR-miR-29b group,&&&P<0.001.Figure 5 Effect of naringenin intervention on the gene expression of 3T3-L1 adipocytes transfected with miR-29b mimics/inhibitor

注:与Cell+普通培养液组相比,∗∗∗P<0.001;与Cell+IR 组相比,###P<0.001;与Cell+IR+miR-29b mimics 转染组相比,&P<0.05,&& P<0.01。图6 柚皮素影响转染miR-29b mimic/inhibitor 3T3-L1 细胞IRS-1、p-Akt 的蛋白表达量Note. Compared with NC group, ∗∗∗P<0.001. Compared with IR group, ###P<0.001. Compared with IR+miR-29b group, &P<0.05,&&P<0.01.Figure 6 Effect of naringenin on the protein expression of IRS-1 and p-Akt in miR-29b mimics/inhibitor 3T3-L1 cells transfected

胰岛素是体内降低血糖的唯一激素,当胰岛素信号传导通路发生障碍时,机体产生胰岛素抵抗,导致肝、脂肪、骨骼肌等靶组织的葡萄糖摄取和利用率降低[13-14]。 胰岛素信号传导通过胰岛素受体促进胰岛素与胰岛素受体底物IRS-1、IRS-2 的结合,然后将信号发出,激活胰岛素下游信号传导通路的蛋白激酶位点,如Akt(也称PKB,PI3K 信号通路成员)被激活[15-16],进而触发下游葡萄糖转运体-4(glucose transporter-4, GLUT-4)向膜转运,降低靶细胞对葡萄糖的摄取能力,引起胰岛素抵抗的发生[17],基于此本实验探究了柚皮素对3T3-L1 脂肪细胞胰岛素抵抗的影响,结果发现3T3-L1 IR 细胞模型IRS-1、GLUT-4 基因和蛋白表达明显降低,通过柚皮素的干预可以起到提高IRS-1/Akt 信号通路的基因和蛋白表达的作用。

MicroRNA(miRNA)是约20~24 个核苷酸的非编码小分子RNA,主要在转录水平上,通过促进目标靶基因降解或抑制其翻译,从而减弱目标靶基因的功能[18]。 近年来大量研究发现miRNA-29 对糖尿病的发生和胰岛素抵抗的调节作用,Mohammed等[5]在临床试验中证实T2DM 患者血清中miR-29b升高,且miR-29b 的高表达与T2DM 疾病严重程度相关, Massart 等[6]通过研究 miRNAs 在 Goto-Kakizaki(GK)大鼠骨骼肌中的表达,鉴定出两种miR-29 被上调,分别是miR-29a 和miR-29b。 Kurtz等[19]研究胰岛素抵抗时发现,在小鼠胰岛素抵抗模型的肝中miR-29 的表达水平比正常小鼠升高。Dooley 等[20]在进行体外试验中,发现3T3-L1 脂肪细胞系中高表达的miR-29 可降低胰岛素刺激的葡萄糖摄取,从而缓解3T3-L1 脂肪细胞胰岛素抵抗。还有研究报道在高糖、高胰岛素诱导体外胰岛素抵抗模型中,高表达的miR-29 可抑制Akt 的激活,降低脂肪细胞对葡萄糖的摄取能力,引起胰岛素抵抗发生[21-22]。 柚皮素对胰岛素抵抗的影响是否也与高表达的miR-29 相关,目前尚无相关报道。 因此,本研究进一步探索了柚皮素对胰岛素抵抗的影响与高表达的miR-29b 的关系,结果发现柚皮素通过抑制miR-29b 的高表达介导3T3-L1 细胞IRS-1/Akt信号通路中相关蛋白的表达,最终改变胰岛素抵抗对脂肪细胞的影响,增强3T3-L1 细胞对胰岛素的敏感性,促进葡萄糖吸收的作用,然而本研究结果仍不能完全解释柚皮素与改善胰岛素抵抗的作用,下一步将从多个蛋白靶点、多个调控环节继续深入研究,阐明柚皮素改善T2DM 的作用及其分子机制。