干扰物对食品检验定性影响的风险实证和控制分析

2022-06-24黄璐瑶余晓琴魏宇涛闵宇航

理化检验-化学分册 2022年6期

黄璐瑶 ,余晓琴 ,魏宇涛 ,闵宇航 ,貌达

(1.四川省食品检验研究院,成都 610097;2.国家市场监管重点实验室(白酒监管技术),成都 610097;3.中国计量科学研究院,北京 100013)

化学分析领域工作中,方法优化及过程质量控制都是为了得到准确可靠的检验结果。检验结果的正确性、准确性和可靠性一直是人们关注的重点。2020年底,媒体爆出日本药企小林化工株式会社发生严重混药事故,导致服用该药物的患者2人死亡、上百人健康受损。据报道,该批次药物在出厂前曾采用液相色谱进行成分分析,出现了一个未知色谱峰,表明其主要成分可能不同,有异物混入,但并未引起公司重视,最终造成事故发生。由此可见,忽略任何一个微小或异常的因素都可能严重影响检验结果。

笔者所在实验室开展食品检验多年,常遇到各种影响定性和定量准确性的事件。及时排查干扰,可有效避免乌龙事件发生,防止错判、误判,保证检验结果与结论的正确性,这对整个食品安全监管工作具有至关重要的作用。目前,食品理化检验的质量控制研究多数集中在检验技术的研发与应用,以及检验过程中人、机、物、料、法、环、测等方面存在的风险因子上[1-6],而关于检验过程中发生干扰的原因分析及其解决措施的研究较少。本工作对食品检验过程中发生的真实干扰案例进行了分析归纳,可为解决干扰问题的控制措施的制定提供参考。

1 干扰案例分类

1.1 高效液相色谱法干扰案例

食品基质复杂,采用高效液相色谱法测定时,若仅通过保留时间定性,可能存在干扰,造成结果偏高甚至假阳性的发生[7-10]。

1.1.1 蜜饯中山梨酸干扰案例

在初始条件下,山梨酸标准品与样品中疑似物的保留时间分别为12.445 min和12.492 min,在线提取光谱,二者分别在波长253 nm 和283 nm 处具有最大吸收,如图1所示。通过改变流动相酸度和洗脱梯度可将二者分离,样品中疑似物的保留时间为13.515 min,山梨酸的保留时间延长至29.868 min,如图2所示。通过标准品比对验证,该干扰物为5-羟甲基糠醛,如图3所示。

图1 初始条件下山梨酸和样品的色谱图及山梨酸和样品中疑似物的紫外-可见吸收光谱图Fig.1 Chromatograms of sorbic acid and the sample,and UV-Vis absorption spectra of sorbic acid and the suspect in the sample under initial conditions

图2 改变分析条件后样品的色谱图及其中疑似物和山梨酸的紫外-可见吸收光谱图Fig.2 Chromatogram of the sample and UV-Vis absorption specta of the suspect and sorbic acid in the sample after changing analytical conditions

图3 改变分析条件后5-羟甲基糠醛的色谱图及紫外-可见吸收光谱图Fig.3 Chromatogram and UV-Vis absorption spectrum of 5-hydroxymethylfurfural after changing analytical conditions

5-羟甲基糠醛主要是由含糖量高的食品在加工和储藏过程中发生美拉德反应和焦糖化反应而产生的,是一种内源性污染物[11-12]。研究表明,山楂、苹果及其制品中展青霉素的测定也存在5-羟甲基糠醛干扰[13-14]。因为这些基质易受曲霉属、青霉属、丝衣霉属等真菌污染[15-17],5-羟甲基糖醛与其次级代谢产物展青霉素具有相似结构,简单的提取和净化步骤很难使二者分离。

1.1.2 奶茶中糖精钠干扰案例

在初始条件下,糖精钠和样品中疑似物的保留时间分别为12.730 min和13.157 min。在线提取光谱,发现二者在205 nm 处均有最大吸收,且紫外-可见吸收光谱图接近,如图4所示。流动相酸度对糖精钠的色谱行为影响很小,通过调整流动相比例成功使二者分离,保留时间分别延长至15.887 min和17.776 min。向样品中加入糖精钠标准品可进一步验证该结论,如图5所示。

图4 初始条件下糖精钠和样品的色谱图及糖精钠和样品中疑似物的紫外-可见吸收光谱图Fig.4 Chromatograms of saccharin and the sample,and UV-Vis absorption spectra of saccharin and the suspect in the sample under initial conditions

图5 改变条件后糖精钠、样品和加标样品的色谱图Fig.5 Chromatograms of saccharin,the sample and the spiked sample after changing analytical conditions

1.1.3 食品、保健食品中其他干扰案例

除上述案例,食品和保健食品检验中还存在其他干扰案例。

调味品中苏丹红Ⅳ,花椒油中丁基羟基茴香醚(BHA),三、四级食用植物油中叔丁基对羟基苯二酚(TBHQ),测定时都易存在干扰,即在目标化合物保留时间附近出现紫外吸收光谱不一致的色谱峰。文献[18]报道,前处理使用的中性氧化铝净化柱活性不好,可导致苏丹红干扰峰形成。文献[19]报道在检测TBHQ 时,发现三、四级菜籽油在HP-5色谱柱上存在干扰。通过加标验证与质谱确证确认干扰存在,更换色谱柱后成功排除假阳性结果。

三氯蔗糖和D-盐酸氨基葡萄糖同属于末端吸收,无法根据紫外吸收光谱定性判定,遇到干扰只能采取质谱确证方法。经验证,三氯蔗糖易受阿斯巴甜干扰,尤其在酱油、豆制品、酱腌菜中时常发生。Cl－则会干扰D-盐酸氨基葡萄糖的测定[20]。

1.2 高效液相色谱-串联质谱法干扰案例

相比高效液相色谱法,高效液相色谱-串联质谱法具有更高的灵敏度和更强大的分析能力,但使用过程中,仍可能遇到干扰情况。

1.2.1 虾中呋喃唑酮代谢物干扰案例

在初始条件下,呋喃唑酮代谢物(AOZ)标准品和样品中疑似物的保留时间均为5.37 min,但标准品色谱峰的相对丰度比值为0.41,样品中疑似物色谱峰的相对丰度比值为2.10,相对丰度比不匹配。同时,通过测定其他虾样品发现,AOZ 其中一对定性离子对[质荷比(m/z)236.0/104.1]的离子通道存在干扰。通过更换色谱柱和梯度洗脱程序,可将疑似物与AOZ 成功分离。向虾样品中加标,进一步确证该分离结果,如图6所示。

图6 改变分析条件后虾加标样品的色谱图Fig.6 Chromatogram of shrimp spiked sample after changing analytical conditions

1.2.2 再制蛋中地美硝唑干扰案例

在初始条件下,地美硝唑标准品和样品中疑似物的保留时间分别为5.58 min和5.63 min,且相对丰度比匹配,疑似检出地美硝唑。更换色谱柱后,二者保留时间变为6.14 min和5.98 min,分离度得到提升,向再制蛋样品中加入地美硝唑标准品,确证该结论,如图7所示。

图7 更换色谱柱后再制蛋加标样品的色谱图Fig.7 Chromatogram of reproductive egg spiked sample after changing chromatographic column

1.2.3 鸡肉中利巴韦林干扰案例

相关试验表明,测定利巴韦林时动物源性基质中常存在一个杂质干扰峰(尿苷,uridine)[21-22]。利巴韦林在普通C18柱上不能保留,文献[22]在优化利巴韦林测定条件时,重点比较了利巴韦林在C8及不同固定相(酰胺基、醇羟基和两性离子)的HILIC柱上的保留效果。笔者实验室遇到干扰问题后,采用不同粒径和长度的色谱柱进行优化,成功将利巴韦林与干扰物分开,见图8。

图8 利巴韦林及干扰物在不同色谱柱的分离Fig.8 Separation of ribavirin and interferent on different chromatographic columns

由图8可看出,利巴韦林在Hypercarb色谱柱上有较好保留。材质相同的情况下,粒径越小,长度越长,分离效果越好。

1.2.4 其他干扰案例

高效液相色谱-串联质谱法中存在的干扰物还可能是目标化合物的同分异构体。如测定1-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑时,三者具有相同母离子和子离子,必须选择合适色谱柱使之完全分离。文献[23]对食用植物油进行检测时发现,乙基麦芽酚的同分异构体与其保留时间相近、特征离子相对丰度比一致,也会产生干扰。

2 食品检验中判断和解决干扰问题的措施

2.1 人员培训

在排除过程污染的情况下,食品检验中干扰来源可分为内源性和外源性两种。内源性干扰包括自身存在的或在生产过程中产生的物质等,如油炸食品中的丙烯酰胺、烤肉中的杂环胺、高糖食品中的5-羟甲基糠醛、牛奶中的苯甲酸等。外源性干扰可能是为了保持食品风味、增强口感、改善外观或其他品质等而人为添加的物质。检验人员需熟悉食品生产工艺,掌握不同类型食品的营养物质及有害物质在生产中的变化,了解添加的或可能由生产带入的物质,这将有助于更科学、更合理地进行综合判定,防止错判、误判。

此外,食品检验过程涉及人员较多,有样品受理和样品预处理人员,也有直接参与试验过程的人员。前者虽不会直接对样品进行检验,也无法确认样品中是否存在干扰,但这个环节如果处理不当可能会造成污染,影响最终测定结果。因此,培训各环节人员掌握污染来源十分重要。

2.2 质量控制

为取得准确可靠的测定结果,需进行过程质量控制,包括空白试验、加标回收或质控样品测定。全试剂空白试验用以验证试验系统有无污染、试剂是否存在干扰,基质空白试验则有助于发现一类样品中是否存在普遍干扰。加标回收和质控样品所选择的基质应尽量与待测样品保持一致,客观反映试验操作过程的同时可通过数据判断是否有干扰的存在。

2.3 进行典型样品实证,建立系统分析方法

食品检验中,分析人员需熟悉仪器性能,积累多项目、多基质的典型色谱图,建立系统分析方法。方法建立时,建议起草单位除优化基本的提取、检测条件外,还应加大对不同类型样品的实证,充分考虑不同基质可能存在的干扰情况,达到优化系统的目的。同时,为保证出具的检验数据和结论客观、公正,分析人员应严格按照规定方法开展检验工作,梳理试验流程,找准各环节可能存在的风险点,并在试验过程中对可能存在的干扰情况进行分析判断,提出解决方案。

对于有紫外或者可见光吸收的化合物,可利用光电二极管阵列检测器进行光谱扫描,通过保留时间一致、光谱图匹配同时进行定性,判断待测化合物是否存在干扰。对于无紫外或弱紫外吸收的化合物,如糖类,使用紫外检测器易受到其他溶剂干扰,影响测定结果,常使用示差折光检测器或蒸发光散射检测器。针对这类无法通过光谱比对的情况,可通过高效液相色谱-串联质谱法确证结果。

在色谱分析中,根据目标化合物性质尽量选择合适的色谱柱、流动相及洗脱程序,在分离目标化合物与干扰物的同时,注意合适的保留时间,如保留时间太短,易有共流物或同分异构体产生干扰。存在疑似干扰时,可优化色谱条件使目标化合物与干扰物分离。优化方式包括调节流动相比例或梯度,调整流动相酸度以及更换色谱柱等。必要时通过高效液相色谱-串联质谱法进行确证。使用高效液相色谱-串联质谱仪时,需关注目标化合物保留时间、相对丰度比,甚至峰形。必要时,除上述提及的3种优化方式外,还可通过更换仪器工作条件,如改变离子源参数或选择不同离子对、多对离子对同时进行测定。条件允许的情况下,还可以采用高分辨质谱进行进一步确认。