反门控去耦技术-定量核磁共振法测定染料木素的含量

李永利,陈 鹰,李 杰

(上海市计量测试技术研究院 理化分析室,上海市在线检测与控制技术重点实验室,上海 201203)

染料木素,又名金雀异黄酮,属于异黄酮类物质,具有抗氧化、预防骨质疏松和类雌激素样等生物活性,因此作为功效成分常用于保健食品中[1-2]。现有染料木素的测定方法主要有液相色谱法[3-4]、液相色谱-质谱联用法[5]和胶束电动毛细管色谱法[6-7]。这些方法的实施都依赖于染料木素标准物质,其测定结果的准确度和所用标准物质的定值准确度密切相关。

定量核磁共振法(q NMR)与传统色谱法相比,主要优点在于测定样品可以不需要待测物质的标准物质,且快速、准确,因此被美国、欧洲、日本和中国药典收录,目前常将绝对定量模式用于对照品研究、组分含量测定和杂质控制评价中[8-18]。目前,核磁共振技术在定量分析方法的开发应用中经常存在如下问题:定量峰附近的氢信号峰因碳-氢偶合效应产生卫星峰,卫星峰容易与定量峰叠加,降低了定量峰信号的积分准确度,从而影响分析方法的定量结果。本工作将反门控去耦技术用于核磁共振氢谱(1H NMR)定量研究,解决了相关卫星峰的干扰效应,提高了氢谱积分准确度;并确定了q NMR 的采集参数、去耦功率、内标物和溶剂,提出了测定染料木素含量的q NMR 方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Avance 500型核磁共振波谱仪;LC-2030型高效液相色谱仪;MX 5型百万分之一电子分析天平;30-300μL移液器。

香草扁桃酸(GBW 09226)的纯度为99.5%;氘代二甲亚砜(DMSO-d6)的纯度为99.8%;染料木素对照品的纯度为99.5%,111704- 201703;染料木素样品,实验室自制。

1.2 仪器工作条件

采用核磁共振波谱仪在25 ℃下采集1H NMR数据。相关参数如下:脉冲序列s2pul;去耦方式为反门控去耦;驰豫延迟时间40 s;脉冲宽度为90°;扫描次数32次;空扫次数4次;采集时间4.0 s;去耦功率40 d B;谱宽8012.8 Hz。按照上述参数对待测溶液进行测定,以染料木素化学位移(δ,×10－6)6.38的峰为定量峰,香草扁桃酸δ6.96为内标信号峰,将得到的1H NMR 数据进行傅里叶变换、相位校正、基线校正和积分处理。

1.3 试验方法

精密称取染料木素样品14.38 mg和香草扁桃酸3.96 mg,用DMSO-d6溶解并定容至2 mL,振荡均匀,即得供试品溶液。移取300μL供试品溶液至核磁管(5 mm)中,按照仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 氘代溶剂的选择和染料木素图谱归属

氘代溶剂的选择主要考虑氘代溶剂对样品的溶解度,以及残留溶剂峰对定量信号的干扰程度。试验分别以氘代三氯甲烷(CDCl3)、氘代甲醇(CD3OD)、DMSO-d6为氘代溶剂,结果发现:CDCl3和CD3OD 都存在溶解性差的问题(溶解度都小于5 g·L－1);染料木素和香草扁桃酸在DMSO-d6中均可以较好溶解,且其波谱信号与残留溶剂峰没有重叠干扰现象。因此,采用DMSO-d6溶解染料木素,采集1H NMR 数据,并进行信号归属,染料木素的信号峰δ:6.22(d,1H,J＝2.0 Hz,H-6),6.38(d,1H,J＝2.0 Hz,H-8),6.82(d,2 H,J＝8.5 Hz,H-3′,5′),7.37(d,2H,J＝8.5 Hz,H-2′,6′),8.33(s,1H,H-2),9.61(s,1 H,4′-OH),10.90(s,1 H,7-OH),12.96(s,1H,5-OH),如图1所示。

图1 染料木素的结构及其在DMSO-d6 中的1 H NMR 谱Fig.1 Structure of genistein and its 1 H NMR spectrum in DMSO-d6

2.2 内标物和定量峰的选择

内标物在q NMR 中需要满足稳定性良好、纯度高,与样品溶解性相似且与样品不产生化学反应等要求。分别以邻苯二甲酸氢钾、苯甲酸和香草扁桃酸为内标物进行试验,结果表明:样品和邻苯二甲酸氢钾的溶解度差别较大,前者在二甲亚砜(DMSO)中溶解度良好,在水中溶解度过小,后者在水中溶解度较好,在DMSO 中溶解度较差;苯甲酸和香草扁桃酸的溶解性与样品相似,香草扁桃酸的信号峰与样品信号峰裂分相似。因此,试验选择香草扁桃酸为内标物。

定量峰的选择主要考察峰是否对称、是否受到干扰。试验选择染料木素δ6.38为定量峰,香草扁桃酸δ6.96为内标物信号峰,如图2所示。

图2 香草扁桃酸的结构和信号峰、染料木素的定量峰Fig.2 Structure and signal peak of vanilmandelic acid,and quantitative peak of genistein

2.3 波谱采集参数和去耦功率的优化

q NMR 的相关参数主要包括驰豫延迟时间、脉冲宽度、扫描次数和采集时间。驰豫延迟时间影响着原子核驰豫,进而与信号峰的积分准确度密切相关。试验在不同的驰豫延迟时间(5,10,20,40,60,80 s)下测定样品,并计算样品定量峰和内标物信号峰的峰面积的比值,结果发现当驰豫延迟时间不小于40 s时,两者的比值保持稳定,因此将驰豫延迟时间设置为40 s。脉冲宽度与驰豫延迟时间共同影响定量峰面积的准确度。分别将30°,45°,60°,90°设置为脉冲宽度,结果发现脉冲宽度为90°时,灵敏度良好,故设定脉冲宽度为90°。

扫描次数影响信噪比,从而影响定量峰的峰面积。扫描次数大时,信噪比高,检测时间长,因此需要在满足信噪比和定量峰面积稳定的前提下,设置较小的扫描次数,以缩短检测时间。在1H NMR 测定中,信噪比与扫描次数成正比,在驰豫延迟时间为40 s时,将扫描次数设定为16,32,64,128次,计算样品定量峰与内标物信号峰的峰面积的比值。结果发现,当扫描次数不小于32次时,比值不再变化,此时染料木素和内标物香草扁桃酸的质量分别为3.390,4.061 mg。采集时间是收集信号变化的时间,其设定需要满足自由感应衰减(FID)信号衰减完全和试验时间尽可能短的要求。设置采集时间分别为1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 s进行测定,结果发现,采集时间为4.0 s时,比值不再变化。因此,扫描次数设置为32次,采集时间设置为4.0 s。

核磁共振采取反门控去耦时,去耦器在驰豫延迟期选择关闭、在采样期选择打开,这种方式结合优化的去耦功率可以大大减小碳氢耦合效应对定量峰的积分准确度的影响[15]。去耦功率分别设置为30,35,38,40,42 dB,结果发现,在去耦功率不小于40 dB时,卫星峰消失,因此去耦功率设置为40 dB(图3)。

图3 普通1 H NMR 谱和反门控去耦1 H NMR 谱Fig.3 Ordinary 1 H NMR spectrum and inverse gated decoupling 1 H NMR spectrum

2.4 标准曲线与检出限

用DMSO-d6配制一系列不同质量比值的染料木素和香草扁桃酸混合溶液[样品和内标物质量比(mg∶mg)分别 为3.390∶4.061,6.986∶3.275,12.620∶3.802,18.036∶3.778,22.582∶3.010,即0.83,2.13,3.32,4.77,7.50],移 取300μL 至核磁 管中,按照仪器工作条件进行测定。以染料木素的定量峰与香草扁桃酸信号峰的峰面积比值对两者的质量比拟合,结果表明,染料木素与内标物香草扁桃酸的质量比在0.83～7.50内,与其定量峰和内标物信号峰的峰面积比值呈线性关系。所得零截距线性回归方程为y＝7.330×10－1x(q NMR 分析中一般线性回归方程为零截距,与理论斜率值0.733 0一致,可以用于定量分析),非零截距线性回归方程为y＝7.223×10－1x＋5.280×10－2(用于检出限的计算),相关系数均为0.999 5。

参照文献[19],计算检出限(3.3s/k),s为非零截距线性回归方程截距的标准偏差,k为非零截距线性回归方程的斜率。所得检出限为0.2 g·L－1,此时图谱中δ6.22,6.38,6.82,7.37和8.33处信号的信噪比均大于250,满足欧洲药典EP10.0 中q NMR检测信噪比不小于150的要求。

2.5 精密度试验

2.5.1 仪器精密度

按照1.3 节试验方法制备供试品溶液,依照1.2节仪器工作条件测定6 次,获得的图谱经相位校正、积分等处理,待测物的定量峰与内标物的信号峰的峰面积比值分别为2.662,2.662,2.647,2.669,2.670,2.654,比值的相对标准偏差(RSD)为0.33%,说明仪器精密度较高。

2.5.2 重复性

按照1.3节试验方法制备6份供试品溶液,依照1.2节仪器工作条件测定,所得的图谱经处理后得到目标峰积分值,计算染料木素的质量分数,分别为97.11%,97.01%,96.37%,96.41%,96.52%,96.96%,RSD 为0.34%,表明方法的重复性较好。

2.6 稳定性试验

将供试品溶液在室温避光条件下保存,分别放置0,3,6,12,24 h后按照1.2节仪器工作条件进行测定,并计算样品的定量峰与内标物信号峰的峰面积的比值,分别为2.670,2.662,2.669,2.652,2.655,RSD为0.30%,表明供试品溶液在避光条件下24 h内稳定。

2.7 样品分析

精密称取3份染料木素样品和香草扁桃酸,配制供试品溶液,按照仪器工作条件进行测定,计算染料木素的质量分数,结果分别为96.63%,96.67%,96.44%,平均质量分数为96.58%。与国家标准GB/T 23788－2009«保健食品中大豆异黄酮的测定方法 高效液相色谱法»的测定结果(染料木素的质量分数为96.21%)相近,表明两种方法的测定结果具有一致性。

本工作以DMSO-d6为溶剂,香草扁桃酸为内标物,驰豫延迟时间为40 s、脉冲宽度为90°、扫描次数为32次和采集时间为4.0 s,提出了q NMR 测定染料木素含量的方法,并进行了方法学验证。采用反门控去耦技术采集参数,通过消除卫星峰的干扰提高积分的准确度,该方法不需要使用待测物质的标准物质,分析时间短,操作简便,可作为色谱法的替代方法,用于染料木素的含量测定,为该类物质含量分析研究提供新的思路。