小续命汤对脑出血小鼠脑组织中线粒体凋亡和自噬的影响*

河北中医学院

郭亚净 任 静 刘 寒 吉恩生△(石家庄 050200)

提要 目的：探讨小续命汤对脑出血(ICH)小鼠脑组织中线粒体介导的细胞凋亡和自噬的作用及机制。方法：健康雄性C57BL/6小鼠随机分为4组(n=12)：假手术组、ICH组、小续命汤治疗组、小续命汤对照组。向ICH组和小续命汤治疗组小鼠右侧纹状体内注入30 μL自体非抗凝血，建立ICH模型。假手术组和小续命汤对照组采用同样的操作过程，但不注入血液。模型建立后，小续命汤治疗组和小续命汤对照组给予小续命汤水煎液，连续灌胃1周后，收集脑组织标本。原位末端标记法(TUNEL)用于观察细胞凋亡情况；免疫组织化学检测用于观察线粒体凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved-caspase-3)和线粒体自噬相关蛋白Beclin-1、微管相关轻链蛋白3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、Parkin、PINK-1的表达情况；Western blot用于检测Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)、NF-κB和p-NF-κB蛋白的表达情况。结果：与假手术组比较，ICH组TUNEL结果显示小鼠血肿周围脑组织中TUNEL阳性细胞数量显著增多(P<0.001)，免疫组织化学检测结果显示Bax、cleaved-caspase-3、PINK-1表达显著上调(P<0.05)，Bcl-2和Bcl-2/Bax比值显著下降(P<0.01)，Western blot结果显示TLR4、MyD88、NF-κB和p-NF-κB蛋白表达显著上调(P<0.05，P<0.01)。与ICH组比较，小续命汤治疗组TUNEL结果显示血肿周围脑组织中TUNEL阳性细胞的数量显著减少(P<0.01)，免疫组织化学检测结果显示Bax、cleaved-caspase-3蛋白表达水平显著下降(P<0.05)，Bcl-2、Bcl-2/Bax比值、Beclin-1、LC3-Ⅱ、Parkin和PINK-1表达水平显著上调(P<0.05，P<0.001)。Western blot结果显示TLR4、MyD88、NF-κB和p-NF-κB蛋白表达水平显著下降(P<0.05，P<0.01)。结论：小续命汤通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路抑制ICH小鼠脑组织中的线粒体凋亡并促进线粒体自噬。

脑出血(ICH)指脑实质内的非创伤性出血，属于中医“中风”范畴。ICH约占脑血管疾病的15%，具有较高的病死率和致残率，仅40%的幸存者可恢复正常[1]。ICH的不良预后归因于血肿及其对大脑的机械压迫所引起的原发性脑损伤和随即出现的继发性脑损伤[2]。然而，手术清除血肿不能显著改善患者的预后，且缺乏有效改善继发性脑损伤的医疗手段[3-4]。

小续命汤在现代临床应用中治疗急性缺血性中风及后遗症疗效显著[5-6]。并且，小续命汤可以改善脑缺血再灌注大鼠的神经功能缺损，减轻缺血性损伤[7]。然而，小续命汤在改善ICH后遗症，缩短急性期疗程方面也具有一定的优势。老中医高允旺善用小续命汤治疗急性ICH昏迷不醒，认为小续命汤为“治疗ICH的金方”[5]。有证据表明，小续命汤可以抑制线粒体介导的细胞凋亡和自噬，从而改善ICH再灌注损伤[8-10]。并且，越来越多的临床和临床前证据表明，凋亡和自噬参与了ICH的病理生理过程[6, 11]。

本研究利用自体血注射小鼠ICH模型，研究小续命汤对ICH后血肿周围脑组织中线粒体介导的细胞凋亡和自噬的影响。

1 材料

1.1 动物 C57BL/6小鼠48只，8～10周龄，体质量约20～25 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：CSXK[京]2016-0006。本实验经河北中医学院实验动物伦理委员会批准，编号DWLL20200068。

1.2 药物与制剂 小续命汤由麻黄、防己、人参、黄芩、桂心、甘草、芍药、川芎、杏仁、附子各9 g，防风12 g，生姜6 g组成，所用中药均购于河北中医学院国医堂，经河北中医学院中药教研室鉴定，符合2020年版《中华人民共和国药典》相关规定。将麻黄用2 L蒸馏水浸泡30 min后加热，沸腾3次，去沫，然后将其余中药放入水中，加热至沸腾，继续微沸煎煮至剩600 mL煎液，过滤煎液后再加1 L蒸馏水，煎煮至剩600 mL煎液，过滤。合并2次过滤后的煎液，加热浓缩至含生药质量浓度为1.62 g/mL的药液，4 ℃保存备用。

1.3 试剂 原位末端标记法(TUNEL)检测试剂盒(中国Servicebio公司，货号GDP1042)；通用SP试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号SP-9002)；DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号ZLI-9017)；RIPA裂解液(中国Servicebio公司，货号G2002)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(中国Servicebio公司，货号G2026)；Bcl-2抗体(中国Boster公司，货号BA0412)；Bax抗体(中国Affinity公司，货号AF0120)；活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved-caspase-3)抗体(美国CST公司，货号14220)；Beclin-1抗体(中国Biogot公司，货号AP0768)；微管相关轻链蛋白3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)抗体(中国Affinity公司，货号AF4650)；Parkin抗体(中国Boster公司，货号PB9307)；PINK-1抗体(中国Affinity公司，货号DF7742)；Toll样受体4(TLR4)抗体(中国Servicebio公司，货号GB11519)；髓样分化因子88(MyD88)抗体(中国Boster公司，货号BA2321)；NF-κB抗体(中国Affinity公司，货号AF5006)；p-NF-κB抗体(中国Affinity公司，货号AF2006)；β-actin抗体(中国Servicebio公司，货号GB11001)；山羊抗兔IgG(中国Servicebio公司，货号G1213)；ECL化学发光试剂盒(中国Servicebio公司，货号G2014)。

1.4 主要设备 全自动脑立体定位仪(51700，stoelting公司，美国)；烘箱(UF160，MEMMERT公司，德国)；正置荧光显微镜(DM5000B，Leica公司，德国)；酶标仪(Varioskan LUX，Thermo Fisher公司，美国)；电泳仪(PowerPac Universal，Bio-Rad公司，美国)；半干转印槽(Trans-BLot Smidry，Bio-Rad公司，美国)；多功能成像系统(Fusion FX5 Spectra，Vilber Lourmat，法国)。

2 方法

2.1 动物分组与模型建立方法 将C57BL/6小鼠随机分为4组(n=12)：假手术组、ICH组、小续命汤治疗组、小续命汤对照组。参考相关文献，建立ICH模型[12]。ICH组和小续命汤治疗组小鼠，1%戊巴比妥钠100 μL/g腹腔注射麻醉。待小鼠彻底麻醉后，将其固定于全自动脑立体定位仪上。剪去头顶毛发，碘伏消毒，剪开头部正中皮肤约0.5 cm，定位前囟，然后以前囟作为原点，向前0.5 mm，向右旁开2.3 mm，标记为穿刺点。用颅钻垂直向下钻开直径约1 mm的小孔。剪断尾尖，取30 μL自体非抗凝血至微量注射器中，用微量注射泵将微量注射器向下推进3.7 mm穿刺进入纹状体，以2 μL/min的速度注入血液，注射结束后停留5 min，缓慢退针。骨蜡封闭小孔，缝合切口。假手术组和小续命汤对照组釆用同样的麻醉及手术操作过程，但不注入血液。模型建立后，根据《人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表》计算出小鼠给药剂量为16.2 g/(kg·d-1)。小续命汤治疗组和小续命汤对照组给予小续命汤，假手术组和ICH组给予等体积生理盐水，连续灌胃1周。

2.2 取材方法 给药结束后，小鼠用冰冷的磷酸盐缓冲液(PBS)进行灌流，将血管内的血液冲洗干净。完整取出脑组织，去除小脑和脑干，仅留大脑。以血液注射进针点冠状面为基准，分别向其前后延伸0.5 mm距离，切取厚约1 mm的脑组织，放入4%组织细胞固定液进行固定，随后进行蜡块包埋和切片，用于病理学检测；用于Western blot检测的脑组织仅留取患侧纹状体，液氮中存放24 h后，转入-80 ℃冰箱备用。

2.3 原位末端标记法(TUNEL)染色 石蜡切片脱蜡至水后，用蛋白酶K进行修复。然后将玻片置于PBS(pH7.4)中洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后滴加破膜工作，常温下孵育20 min。PBS(pH7.4)中洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后滴加buffer，常温孵育10 min后滴加反应液(TDT酶、dUTP和buffer按1∶5∶50比例混合)，放于湿盒内，37 ℃恒温箱孵育2 h。切片用PBS(pH7.4)洗涤3次，每次5 min。滴加DAPI复染细胞核，避光室温孵育10 min。切片置于PBS(pH7.4)中洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干，用抗荧光淬灭封片剂封片。切片于倒置荧光显微镜下观察并采集图像，用ImageJ软件分析TUNEL阳性细胞数量。

2.4 免疫组织化学 石蜡切片脱蜡至水后，切片置于柠檬酸抗原修复缓冲液中进行微波抗原修复。切片室温冷却后于PBS(pH7.4)中洗涤3次，每次5 min。然后，滴加3%双氧水溶液，室温避光孵育15 min，以阻断内源性过氧化物酶。切片置于PBS(pH7.4)中洗涤3次，每次5 min。在切片上滴加3% BSA，室温封闭15 min。轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS(pH7.4)按一定比例配好的一抗，置于湿盒内4 ℃孵育过夜。第2 d，将玻片置于PBS(pH7.4)中洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后滴加生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，室温孵育30 min。切片置于PBS(pH7.4)中洗涤3次，每次5 min。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育15 min。切片置于PBS(pH7.4)中洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。然后复染细胞核，脱水、透明后中性树胶封片。切片于倒置显微镜下观察并采集图像，用ImageJ软件分析。

2.5 Western blot 纹状体脑组织内按一定比例加入RIPA裂解液提取蛋白。离心后，取上清，用BCA试剂盒测定蛋白质含量。将上清与5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液按1∶4比例混匀后，于100 ℃进行蛋白变性5 min。随后，将制备好的样本进行上样、电泳、转膜和脱脂奶粉封闭，TLR4、MyD88、NF-κB、p-NF-κB和β-actin抗体用TBST按一定比例稀释后，4 ℃孵育过夜。TBST洗涤3次，每次15 min。孵育HRP标记的二抗后，用ECL化学发光试剂盒来检测蛋白表达。采用Image J软件进行灰度值分析。以目的蛋白与β-actin灰度比值表示各目的蛋白的相对表达量。用于观察脑组织中TLR4、MyD88、NF-κB和p-NF-κB蛋白表达及激活情况。

3 结果

3.1 小续命汤对ICH小鼠血肿周围脑组织中TUNEL阳性细胞数量的影响 与假手术组比较，ICH组小鼠脑组织TUNEL阳性细胞数量显著增加(P<0.001)；与ICH组比较，小续命汤治疗组小鼠脑组织中TUNEL阳性细胞数量显著减少(P<0.01)。见图1。

注：A.假手术组；B.ICH组；C.小续命汤治疗组；D.小续命汤对照组(图2～图4同)；与假手术组比较，*** P<0.001；与ICH组比较，## P<0.01。图1 小续命汤对ICH小鼠血肿周围脑组织中凋亡细胞数量的影响(TUNEL，×400)

3.2 小续命汤对ICH小鼠血肿周围脑组织中Bcl-2、Bax和cleaved-caspase-3蛋白表达的影响 与假手术组比较，ICH组小鼠脑组织中Bcl-2和Bcl-2/Bax比值显著降低(P<0.01)，Bax和cleaved-caspase-3显著升高(P<0.05)；与ICH组比较，小续命汤治疗组小鼠脑组织中Bcl-2和Bcl-2/Bax比值显著升高(P<0.05)，Bax和cleaved-caspase-3显著降低(P<0.05)。见图2、表1。

图2 小续命汤对ICH小鼠血肿周围脑组织中Bcl-2、Bax和cleaved-caspase-3蛋白表达的影响(免疫组化，×400)

表1 小续命汤对ICH小鼠血肿周围脑组织中Bcl-2、Bax和cleaved-caspase-3蛋白表达的影响

3.3 小续命汤对ICH小鼠血肿周围脑组织中Beclin-1、LC3-Ⅱ、Parkin和PINK1蛋白表达的影响 与假手术组比较，ICH组小鼠脑组织中PINK1表达显著升高(P<0.05)，而Beclin-1、LC3-Ⅱ和Parkin表达虽有升高，但差异无显著性(P>0.05)；小续命汤治疗组小鼠脑组织中Beclin-1、LC3-Ⅱ、Parkin和PINK1表达均显著升高(P<0.05，P<0.001)；与ICH组比较，小续命汤治疗组小鼠脑组织中Parkin和PINK1表达显著升高(P<0.05)，Beclin-1和LC3-Ⅱ表达虽有升高，但差异无显著性(P﹥0.05)。见图3、表2。

图3 小续命汤对ICH小鼠血肿周围脑组织中Beclin-1、LC3-Ⅱ、Parkin和PINK1蛋白表达的影响(免疫组化，×400)

表2 小续命汤对ICH小鼠血肿周围脑组织中Beclin-1、LC3-Ⅱ、Parkin和PINK1蛋白表达的影响

3.4 小续命汤对ICH小鼠血肿周围脑组织中TLR4、MyD88、NF-κB和p-NF-κB蛋白表达的影响 与假手术组比较，ICH组小鼠脑组织中TLR4、MyD88、NF-κB和p-NF-κB均显著升高(P<0.05，P<0.01)；与ICH组比较，小续命汤治疗组小鼠脑组织中TLR4、MyD88、NF-κB和p-NF-κB均显著降低(P<0.05，P<0.01)。见图4、表3。

图4 小续命汤对ICH小鼠血肿周围脑组织中TLR4、MyD88、NF-κB和p-NF-κB蛋白表达的影响

表3 小续命汤对ICH小鼠血肿周围脑组织中TLR4、MyD88、NF-κB和p-NF-κB蛋白相对表达水平的影响

4 讨论

小续命汤为唐代治疗中风第一要方。由于对中风病机的认识由“外风”转变为“内风”，小续命汤在金元及其后期逐渐不被主流医家认可。随着国家对中医药传承工作的重视，古代经典名方的临床价值再次受到医家及学者们的关注，小续命汤也被重新提及。

中风包括现代医学中的脑梗死、ICH、短暂性脑缺血发作等脑血管疾病。小续命汤可以提高中风恢复期患者的生活能力，改善其生活质量[13-14]。

临床观察发现，小续命汤联合西医治疗可以缩小ICH病人的血肿体积，减轻患者神经损伤、肢体功能障碍等后遗症[15-17]。实验研究显示，小续命汤可以缩小ICH大鼠的血肿体积，改善局部脑血流、降低脂质过氧化物的活性，阻止细胞外Ca2+内流以控制、减轻脑水肿[18-19]。然而，小续命汤发挥ICH治疗作用的机制有待进一步研究。

细胞凋亡参与多种脑血管疾病的病理过程，与ICH后血肿周围组织的神经元丢失密切相关[6]。抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少或促凋亡蛋白Bax表达增多均可导致细胞凋亡增强。Bcl-2/Bax比值稳定在一定水平，可维持膜电位，防止线粒体凋亡途经重要信号蛋白细胞色素C释放入细胞质中而引起凋亡。Cleaved-caspase-3则是细胞凋亡进入不可逆阶段的标志。研究发现，小续命汤有效成分可以升高慢性脑缺血大鼠脑组织中的线粒体膜电位，减少细胞色素C释放，升高Bcl-2/Bax比值，抑制caspase诱导的下游级联，从而减轻神经元凋亡[8, 20]。笔者的研究结果显示，小续命汤显著减少了ICH小鼠血肿周围TUNEL阳性细胞的数量，增加了脑组织中Bcl-2的表达和Bcl-2/Bax比值，降低了Bax和cleaved-caspase-3的表达。结果表明，小续命汤抑制了ICH小鼠血肿周围组织的细胞凋亡。

自噬与ICH病人和实验动物的神经元损伤相关，抑制线粒体自噬可以减轻ICH后的继发性脑损伤[21]。Beclin-1是自噬引发阶段的关键调控因子[22]。当线粒体受到去极化刺激后，触发PINK1/Parkin通路调控的线粒体自噬，泛素化的线粒体蛋白与LC3-Ⅱ共同形成自噬小体[23]。Lan等发现小续命汤通过下调自噬基因LC3、Beclin-1、Lamp1和线粒体P62的表达来抑制线粒体自噬，对脑缺血再灌注损伤发挥神经保护作用[10]。而笔者的研究结果显示，小续命汤显著增加了ICH小鼠血肿周围脑组织中Beclin-1、LC3-Ⅱ、Parkin和PINK1表达。结果表明，小续命汤促进ICH小鼠血肿周围脑组织中的线粒体自噬。笔者推测这种相反的研究结果，可能与ICH后不同时间段的病理生理特征有关，此时增强线粒体自噬，可以通过清除老化的胞内细胞器和错误折叠的蛋白质，保护细胞免受缺血和缺氧等刺激。

TLR4被激活后可以通过MyD88依赖和非依赖两条途径激活NF-κB，从而产生生物学效应[24]。抑制或阻断TLR4/MyD88/NF-κB通路，可以使胞浆中细胞色素C水平升高，线粒体中细胞色素C水平降低，降低cleaved-caspase-3表达，从而抑制细胞的线粒体凋亡[25-26]。并且，抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路，也可以抑制线粒体自噬[27]。吴海洋等研究发现，小续命汤联合超早期针刺督脉可以显著改善脑缺血再灌注模型大鼠神经功能缺损情况并抑制自噬相关蛋白NF-κB p65活性，保护脑功能[28]。另外，体外和在体实验均显示，小续命汤可以降低小胶质细胞TLR4和MyD88的表达[29]。同样，笔者的研究结果显示，小续命汤降低了ICH小鼠血肿周围脑组织中TLR4、MyD88、NF-κB 和p-NF-κB的表达。

综上所述，小续命汤抑制了ICH小鼠血肿周围脑组织中的细胞凋亡，促进了线粒体自噬，这可能与其对TLR4/MyD88/NF-κB通路的调控作用相关。进一步完善了小续命汤治疗ICH的作用机制。