乌司他丁对老年系统性红斑狼疮脑病小鼠神经功能及预后的影响

李中骞 石鑫岳 许敏

(1内蒙古巴彦淖尔市医院风湿免疫科，内蒙古 巴彦淖尔 015000;2内蒙古医科大学附属医院风湿免疫科)

系统性红斑狼疮(SLE)继发脑病是一种全身多系统受累的自身免疫性疾病，也是SLE最严重的并发症，发病机制较复杂，其中出现中枢神经系统损害是SLE病情危重的临床征兆，也是SLE危象导致死亡的主要原因之一，对其确切的病因目前尚未明确〔1，2〕。SLE脑病临床表现多样，其可发生在 SLE 病程的任何时间，病情呈反复发作与缓解交替，而且大部分患者预后均较差，且主要以激素治疗为主，对于老年患者激素治疗不良反应大、并发症及死亡率高，探讨新的副作用小的药物意义重大〔3，4〕。研究报道乌司他丁是人体内的一种内源性保护物质，具有广泛的生物活性，可减轻脑损伤后对机体造成的病理损害，研究表明乌司他丁可对严重的心、脑、肺等损害发挥显著治疗作用，是目前治疗SLE的潜力药物〔5，6〕。本研究拟通过乌司他丁对比泼尼松干预，观察二者对老年SLE小鼠继发SLE脑病脑组织中趋化因子 CXCL12 及其受体CXCR4 mRNA、蛋白表达的影响，初步探讨乌司他丁对老年SLE继发脑病小鼠神经功能的保护及对死亡率的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物及试剂 实验动物：雄性MRL/lpr SLE小鼠，14月龄。90只，体重41～45 g，由内蒙古大学实验动物研究中心提供，实验动物使用许可证号：SCXK(蒙)2009-0001。SPF环境中，正常饲料喂养，自由饮水。主要试剂：乌司他丁(国药准字H19990133，广东天普生化医药股份有限公司)；醋酸泼尼松龙注射液(国药准字H20023134，浙江仙琚制药股份有限公司);乙二胺四乙酸(EDTA，天津市化学试剂一厂)；Tunnel试剂盒(Roche公司)；mRNA提取试剂盒、Taq酶(美国MBI);聚合酶链反应(PCR)试剂盒(大连宝生生物公司提供)；CXCL12、CXCR4、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物由北京赛百胜生物技术公司合成；CXCL12、CXCR4单克隆抗体(SANTA公司产品)；GAPDH兔抗鼠多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG 抗体(美国Santa Cruz公司)； Morris水迷宫DMS-2系统(中国科学院药物研究所)；Morris水迷宫分析软件(荷兰Noldus公司);二氧化碳培养箱(Thermo Forma公司)；超净工作台( 苏州安泰空气技术公司)；荧光倒置显微镜(德国Leica公司)；凝胶成像系统(日本Kodak)。

1.2方法

1.2.1动物分组及给药 90只雄性MRL/lpr SLE小鼠随机数字表法分组，每组30只，分为空白组：腹腔注射生理盐水30 mg/(kg·d)；乌司他丁组：腹腔注射乌司他丁给药50 000 U/(kg·d);泼尼松组：腹腔注射泼尼松给药1 mg/(kg·d)，腹注给药15 d，间隙15 d，给药4个月。

1.2.2小鼠学习记忆行为测定 各组SLE小鼠学习记忆行为测定(跳台法)将小鼠放入YLS-3T跳台记录仪内，适应60 s后通电(25 V)，小鼠受到电击。其正常反应为跳至平台上对伤害性刺激进行躲避。对小鼠首次找到平台所需的时间(反应时间)以及300 s内受到电击次数(错误次数)进行记录，作为其学习成绩。24 h后重复该实验。对小鼠第1次从平台上跳下的时间(潜伏期)以及错误次数进行记录，作为其记忆成绩。

1.2.3血肿瘤坏死因子(TNF)-α、转化生长因子(TGF)-β的测定 各组随机取5只分别于干预中期(2个月)及末期(4个月)取血3 ml(以200 g/L的乌拉坦按1.2 g/kg经腹腔内注射麻醉，仰卧位固定，心脏穿刺取血3 ml)，收集的血液静置30 min，常温离心(3 700 r/min；10 min)，取血清，分装(100 μl/EP管)后置于-80℃深低温冰箱，备用。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清TGF-β、TNF-α表达水平。

1.2.4各组存活率 记录各组自然死亡情况，以每个月为时间节点，绘制小鼠存活率的曲线图。

1.2.5病理检测 动物处死后，取小鼠脑组织通过10%甲醛固定，予以石蜡包埋，常规切片4 mm，80℃烤箱烤片后对组织切片进行苏木素-伊红(HE)染色：苏木素染色5 min后，经自来水冲洗，盐酸乙醇分化10 s，再次自来水冲洗10 min，伊红染色7 min，自来水洗后，以梯度乙醇脱水，经二甲苯透明，通过中性树胶封固。中性树胶封片后镜检。

1.2.6TUNEL染色 参照TUNEL试剂盒说明步骤操作，取小鼠脑组织石蜡切片经脱蜡及梯度酒精进行脱水，磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，5 min/次，柠檬酸缓冲液(pH6.0)行微波修复15 min，37℃下蛋白酶K消化30 min，3%过氧化氢(H2O2)进行封闭后、PBS洗3次，5 min/次，DNaseI反应液制作阳性对照，反应10 min，PBS洗3次，5 min/次，加入50 μl的末端脱氧核苷转移酶(TdT)反应液50 μl，避光37℃下反应60 min，PBS洗3次，5 min/次，加入免疫组化(IHC)工作液，37℃避光反应30 min，PBS洗3次，5 min/次，二氨基联苯酸(DAB)呈色、梯度酒精脱水，中性树胶封片，荧光显微镜下对10个200倍视野进行观察，计凋亡细胞数。

1.2.7RT-PCR 取50 mg小鼠脑组织，液氮中研碎，加入预分装的1 ml Trizol溶液中提取RNA，紫外分光光度仪测定RNA含量，按MMLV 试剂盒步骤将RNA 逆转录成cDNA再将cDNA进行RT-PCR。

按照Trizol说明书方法提取组织总RNA，以总RNA 为模板、Oligo (dT) 为引物，通过RT-PCR两步法试剂盒将mRNA逆转录成cDNA，CXCL12：上游5′-GTCAGCCTGAGCTACCGA-3′，下游5′-GAAGGGCACAGTTTGGAG-3′；CXCR4：上游5′-GGCTGACCTCCTCTTTGT-3′，下游5′-GTTTCCTTGGCCTTTGAC-3′；GAPDH：上游5′-ACAGCCGCATCTTCTTGTGCAGTG-3′,下游5′-GGCCTTGACTGTGCCGTTGAATTT-3′。95℃预变性1 min，95℃变性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸30s，共40个循环，将扩增产物电泳，通过凝胶图像处理系统分析光密度，以CXCL12、CXCR4基因片段与GAPDH片段灰度值的比值作为其相应表达水平。

1.2.8Western印迹 将RT-PCR提取剩余物以1 500 r/min离心30 min，取上清粗体蛋白，用Bradford法行蛋白定量。5%浓缩胶40 V衡压1 h，10%分离胶恒压60 V，3.5 h，14 V恒压湿转14 h，37℃摇床上封闭2 h，待转印后加入一抗：兔抗小鼠CXCL12 抗体或兔抗小鼠CXCR4抗体(1∶800)4℃过夜；兔抗小鼠GAPDH(1∶5 000)4℃过夜。TBST洗膜5 min×4次，山羊抗兔抗体1∶700，37℃摇床孵育1.5 h，TBST 洗膜5 min×4次。DAB显色。重复3次。Quantity One图像分析。CXCL12、CXCR4与β-actin灰度比值进行分析。

1.3统计学方法 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1各学习记忆行为分析 3组学习能力潜伏期、错误次数无显著差异(P>0.05)；空白组记忆能力潜伏期显著低于其余两组(P<0.05)，而3组记忆能力错误次数无显著差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组学习记忆行为分析

2.2各组TNF-α、TGF-β水平比较 药物干预2、4个月，空白组TNF-α水平显著高于其余两组，TGF-β水平显著低于其余两组(P<0.05)。见表2。

表2 各组TNF-α 、TGF-β水平比较

2.3各组存活率比较 药物干预4个月，空白组、泼尼松组、乌司他丁组存活〔21只(70.0%)、24只(80.0%)、28只(93.3%)〕。乌司他丁组存活率显著高于其余两组(P<0.05)。

2.4各组脑组织病理 空白组脑组织中可见大量炎性因子、散在出血点，组织水肿，神经元细胞受到抑制；而泼尼松组和乌司他丁组以上的病理变化大大减轻或消失，神经元细胞增生较空白组活跃，见图1。

图1 各组脑组织(HE染色，×40)

2.5各组脑组织细胞凋亡 荧光显微镜下观察细胞呈绿色荧光的为阳性细胞(凋亡细胞)，泼尼松组(27.23±3.46)个/高倍镜和乌司他丁组(28.48±3.76)个/高倍镜，空白组脑组织凋亡细胞数(67.54±4.38)个/高倍镜，乌司他丁组和泼尼松组细胞凋亡水平显著低于空白组(P<0.05)，见图2。

图2 各组脑组织凋亡(TUNEL，×200)

2.6各组脑组织中CXCL12和CXCR4 mRNA水平比较 3组CXCL12、CXCR4 mRNA水平比较：空白组>泼尼松组>乌司他丁组(P<0.05)。见表3、图3。

2.7各组脑组织中CXCL12和CXCR4 蛋白水平比较 3组CXCL12、CXCR4 蛋白水平比较：空白组>泼尼松组>乌司他丁组(P<0.05)。见图4、表4。

表3 各组脑组织中CXCL12和CXCR4 mRNA 水平比较

图3 各组脑组织中CXCL12和CXCR4 mRNA水平比较

图4 Western印迹检测CXCL12、CXCR4蛋白水平比较

表4 各组脑组织中CXCL12和CXCR4蛋白 水平比较

3 讨 论

SLE小鼠继发脑病后，一般预后不良，生活质量严重下降。SLE脑病的发病机制较为复杂，研究表明其发病机制可能与免疫复合物沉积性血管炎、磷脂抗体的损害、抗神经元抗体及脑组蛋白抗体反应、抗核糖体 P蛋白抗体致病、低蛋白血症等因素有关〔7〕。此外SLE脑病的临床表现也各异，又受遗传、环境等因素的影响。临床上对此病的治疗主要有免疫抑制剂治疗、激素疗法及对症治疗等，但均未能彻底治疗，且激素治疗副作用严重，对于老年患者发生股骨头坏死及感染等并发症概率增加〔8，9〕。

乌司他丁是一种广谱酶抑制剂，有抗休克、抑制炎症因子、玻璃酸酶、 胰蛋白酶、纤溶酶和弹性蛋白酶等多种酶的活性及清除自由基等作用，研究报道称乌司他丁是从男性新鲜尿液中提取的一种糖蛋白，对休克、手术伤害、肿瘤放化疗反应等可发挥辅助治疗作用〔8，9〕。有研究认为，鸟司他丁发挥疗效的作用机制可能为：抑制机体蛋白质的分解亢进，改善免疫功能，改善肾功能，减轻脑损伤后的脑水肿、水电解质紊乱、意识模糊、消化道出血、代谢失衡、感染等〔10～12〕。

本研究结果提示乌司他丁可能通过提高小鼠神经元细胞活跃性，增强小鼠的记忆能力、学习记忆行为；乌司他丁通过调低CXCL12 及其受体CXCR4的表达水平，抑制SLE小鼠继发脑病效果好。