穿山龙总皂苷经Nrf2/ARE通路抑制慢性肾脏病大鼠血管钙化的作用

马娟 郭银雪 谢恂 张晶晶 黄宁川 (贵州中医药大学第一附属医院肾内科，贵州 贵阳 550000)

Inhibition effect of total saponin from rhizoma dioscorea nipponica on vascular calcification in rats with chronic kidney disease via Nrf2/ARE pathway

MA Juan, GUO Yin-Xue, XIE Xun,etal.

Department of Nephrology, the First Affiliated Hospital of Guizhou University of traditional Chinese medicine, Guiyang 550000, Guizhou,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the inhibition effect of total saponin from rhizoma dioscorea nipponica (TSRDN) on vascular calcification in rats with chronic kidney disease via nuclear factor erythroid E2-related factor(Nrf2)/antioxidant response element (ARE) pathway.Methods50 SPF grade adult male SD rats were randomly divided into control group, model group, TSRDN low dose group, TSRDN high dose group and calcitriol group, 10 rats in each group. The control group was fed with ordinary feed, and the remaining groups were fed with adenine (250 mg/kg, once/day) by gavage and fed with 1.8% high phosphorus feed for 4 weeks. At weeks 5～8, adenine was changed to gavage every other day. At the same time, TSRDN (80 mg/kg, 160 mg/kg) was administered orally to TSRDN low dose group and TSRDN high dose group by gavage. In the calcitriol group, calcitriol (0.045 μg/kg) was given by gavage, gavage volume 3 ml, the control group and the model group were orally administered with an equal volume of normal saline,once a day, continuous administration for 8 weeks. Blood samples were taken from the femoral artery, and the levels of calcium (Ca), phosphorus (P), serum creatinine (Scr), and urea nitrogen (BUN) were measured with an automatic biochemical analyzer, and then kidneys and aortic tissue were taken for hematoxylin-eosin (HE) staining to observe histological changes, and real-time qRT-PCR was used to detect Nrf2, heme oxygenase(HO)-1, NADPH quinineoxidoreductase(NQO)-1, γ-glutamylcysteine synthetase(γ-GCS), runt-related transcription factor(RUNX)2 and bone morphogenic protein(BMP)2 mRNA levels in the aorta.ResultsThe renal and aortic vascular structures of the control group rats were normal; the renal and aortic structures of the model group rats were severely damaged, and a large amount of crystalline adenine metabolites were deposited, and a continuous linear linear obvious calcified nodule was seen at the arterial media. Compared with the model group, the kidney lesions of rats in each TSRDN dose group and calcitriol group were significantly reduced, and adenine crystals were reduced, vascular structure damage reduced, and calcified nodules were reduced, which in the TSRDN high-dose group and calcitriol group were more obvious. Compared with the control group, the levels of Ca, Nrf2, HO-1, NQO-1, and γ-GCS mRNA in the model group, each TSRDN dose group and the calcitriol group were significantly decreased, and the levels of P, Scr, BUN, RUNX2 and BMP2 mRNA obviously increased(P<0.05). Compared with the model group, the levels of Ca, Nrf2, HO-1, NQO-1, and γ-GCS mRNA in rats in each TSRDN dose group and calcitriol group were significantly increased, and the levels of P, Scr, BUN, RUNX2 and BMP2 mRNA significantly decreased, and it was dose-dependent(P<0.05). The effect of TSRDN high dose group and calcitriol group was similar (P>0.05).ConclusionsTSRDN could improve renal function, calcium and phosphorus metabolism and inhibit vascular calcification in CKD rats. The mechanism might be related to the activation of Nrf2/ARE pathway by TSRDN.

【Keywords】 Total saponin from rhizoma dioscorea nipponica; Nrf2/ARE pathway; Chronic kidney disease; Vascular calcification

慢性肾脏病(CKD)是一个日益严重的公共卫生问题，其潜在结果是终末期肾病(ESRD)〔1〕。血管钙化(VC)是磷酸盐在血管组织中沉积的病理过程，常被认为是与ESRD相关的心血管疾病的主要危险因素〔2〕。CKD或ESRD患者的高心血管发病率和死亡率与VC的表现有关，而VC被怀疑与高磷血症有关，高水平的磷酸盐直接影响血管平滑肌细胞(VSMCs)并诱导钙化〔3〕。因此，寻找VC的潜在分子靶点可能有助于CKD的治疗。核因子E2相关因子(Nrf)2/抗氧化反应元件(ARE)通路是氧化应激和炎症反应的主要传感器和调节因子，与CKD的进展以及抗氧化和解毒有关〔4〕。Nrf2被发现是氧化应激介导的疾病的主要调节因子，当与ARE结合时，有助于调节细胞抗氧化和抗炎防御相关基因的表达〔5〕。研究表明，VC中Nrf2浓度较低，通过激活VSMCs中的Nrf2可以减弱VC〔6〕。穿山龙是薯蓣科多年生藤本植物穿山龙薯蓣根茎，对类风湿关节炎和过敏性皮炎等具有治疗作用〔7〕。穿山龙总皂苷(TSRDN)为穿山龙提取物，具有良好的抗炎和免疫抑制作用，但TSRDN对VC的研究较少〔8〕。因此，本研究建立CKD大鼠模型，研究穿TSRDN通过调节Nrf2/ARE通路是否能减弱VC，探讨TSRDN治疗CKD血管钙化的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级成年雄性SD大鼠购自上海交通大学实验动物中心，12～14周龄，体重280～320 g，动物生产许可证号：SCXK(沪)2018-0004，动物使用许可证号：SYXK(沪)2018-0019，动物质量合格证号：20190547，所有大鼠在贵州中医药大学第一附属医院动物房中饲养，饲养温度25℃左右，湿度60%左右。

1.2主要试剂与仪器 TSRDN(原料药，纯度99%，杭州达文生物有限公司，批号J-0670158)；骨化三醇(剂型：胶囊剂，规格0.25 μg，上海罗氏制药有限公司，批号20190519)；腺嘌呤(纯度99%，上海源聚生物科技有限公司，批号071226)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司，批号DP421)；qScript cDNA SuperMix试剂盒和荧光定量PCR试剂盒(大连TaKaRa公司，批号RR047A、TK08045)：ASP300S型组织脱水机、EG1150型包埋机、Leica RM2255型全自动轮转切片机等病理配套设备(德国Leica公司)；AU5800型全自动生化分析仪(美国贝克曼库尔特公司)；DM2700P型显微镜(德国徕卡公司)；NanoDrop2000c型蛋白核酸检测仪(美国Thermo公司)；CFX-96型实时定量PCR仪(美国BD公司)。

1.3分组造模〔9〕及给药 选50只大鼠适应性喂养1 w后进行实验。将大鼠随机分为对照组、模型组、TSRDN低剂量组、TSRDN高剂量组和骨化三醇组，每组10只。对照组用普通饲料喂养，其余各组用腺嘌呤(250 mg/kg，1次/d)灌胃和含1.8%高磷饲料喂养，连续4 w。第5～8周腺嘌呤改为隔日灌胃〔9〕，同时TSRDN低剂量组和TSRDN高剂量组分别灌胃给予TSRDN(80 mg/kg、160 mg/kg)〔10〕，骨化三醇组灌胃给予骨化三醇(0.045 μg/kg)〔11〕，灌胃体积3 ml，对照组和模型组灌胃给予等体积(3 ml)生理盐水，每天给药1次，连续给药8 w后进行相关检测。

1.4血清学指标的检测 麻醉大鼠进行股动脉取血，分离血清，用全自动生化分析仪检测钙(Ca)、磷(P)、血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)水平。

1.5大鼠肾脏和主动脉组织形态学检查 大鼠采血后，迅速摘取右侧肾脏，去除包膜及肾周脂肪，同时分离剥离胸主动脉，进行甲醛固定，经脱水、包埋、切片(1 μm)，进行苏木素-伊红(HE)染色，显微镜观察组织学变化。

1.6主动脉中Nrf2、血红素加氧酶(HO)-1、磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化还原酶(NQO)-1、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)、核心结合蛋白因子(RUNX)2和骨形态发生蛋白(BMP)2 mRNA水平测定 每组用5只大鼠取胸主动脉制成匀浆，使用TRizol试剂提取总RNA，通过NanoDrop2000c型蛋白核酸检测仪的260/280 nm和260/230 nm的吸光度值评估RNA水平和纯度。使用qScript cDNA SuperMix试剂盒进行逆转录，实时qRT-PCR分析在CFX-96型实时定量PCR仪上进行。Nrf2、HO-1、NQO-1、γ-GCS、RUNX2和BMP2和β-actin引物由大连TaKaRa公司合成。引物序列：Nrf2上游引物为5′-CACATTCCCAAACAAGATGC-3′，下游引物为5′-TCTTTTCCAGCGAGGAGAT-3′；HO-1上游引物为5′-CGTGCTCGAATGAACACTCT-3′，下游引物为5′-GGAAGCTGAGAGTGAGGACC-3′；NQO-1上游引物为5′-CATCATTCAACTACGCCATG-3′，下游引物为5′-GTCCTTCAGCTCACCTGTGA-3′；γ-GCS上游引物为5′-TTACCGAGGCTACGTGTCAG-3′，下游引物为5′-CAAAAAGGGTGAGTGGGTCT-3′；RUNX2上游引物为5′-GCCGAGATCTCACCGACTAC-3′，下游引物为5′-GTCCAGAGCGACATAGCACA-3′；BMP2上游引物为5′-TCAAGCCAAACACAAACAGC-3′，下游引物为5′-ACATTCCCCATGGCAGTAAA-3′；β-actin上游引物为5′-GTTGGTTGGAGCAAACATCC-3′，下游引物为：5′-AAGCAATGCTGTCACCTYCC-3′。根据荧光定量PCR试剂盒说明，制备20 μl反应体系进行扩增，反应条件为95℃预变性1 min，95℃变性30 s，60℃退火5 s，共38个循环，72℃延伸5 s。采集荧光，以β-actin作为内参，采用2-ΔΔCt法计算Nrf2、HO-1、NQO-1、γ-GCS、RUNX2和BMP2 mRNA的表达量。

1.7统计学分析 采用SPSS23.0进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1TSRDN对大鼠肾脏组织形态学的影响 对照组大鼠肾脏小球结构正常清晰，肾小管上皮细胞排列整齐，肾间质未见成纤维细胞及炎细胞；模型组大鼠肾间质增生，肾小管破坏管腔扩大，伴炎性细胞间质浸润，见大量黑色腺嘌呤代谢物结晶沉积；与模型组比较，各TSRDN剂量组和骨化三醇组大鼠肾小球，肾小管和间质病变明显减轻，腺嘌呤结晶减少，TSRDN高剂量组和骨化三醇组较为明显。见图1。

2.2TSRDN对大鼠主动脉钙化的影响 对照组大鼠主动脉血管结构正常；模型组大鼠血管结构破坏严重，在动脉中膜处见连续性线性分布的明显钙化结节；与模型组比较，各TSRDN剂量组和骨化三醇组大鼠结构破坏减轻，钙化结节减少，TSRDN高剂量组和骨化三醇组较为明显。见图2。

图1 TSRDN对大鼠肾组织形态学的影响(HE染色，×100，箭头所指处为腺嘌呤结晶)

2.3TSRDN对大鼠血清中Ca、P、Scr和BUN水平的影响 与对照组比较，模型组、各TSRDN剂量组和骨化三醇组大鼠血清中Ca水平降低，P、Scr和BUN水平升高(P<0.05)；与模型组相比，各TSRDN剂量组和骨化三醇组大鼠血清中Ca水平升高，P、Scr和BUN水平降低，且呈剂量依赖性(P<0.05)；TSRDN高剂量组和骨化三醇组作用相似，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 TSRDN对大鼠血清中Ca、P、Scr和BUN水平的影响

2.4TSRDN对大鼠主动脉中Nrf2、HO-1、NQO-1和γ-GCS mRNA水平的影响 与对照组比较，模型组、各TSRDN剂量组和骨化三醇组大鼠主动脉中Nrf2、HO-1、NQO-1和γ-GCS mRNA水平降低(P<0.05)；与模型组相比，各TSRDN剂量组和骨化三醇组大鼠主动脉中Nrf2、HO-1、NQO-1和γ-GCS mRNA水平升高，且呈剂量依赖性(P<0.05)；TSRDN高剂量组和骨化三醇组作用相似，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.5TSRDN对大鼠主动脉中RUNX2和BMP2 mRNA水平的影响 与对照组比较，模型组、各TSRDN剂量组和骨化三醇组大鼠主动脉中RUNX2和BMP2 mRNA水平增高(P<0.05)；与模型组相比，各TSRDN剂量组和骨化三醇组大鼠主动脉中RUNX2和BMP2 mRNA水平降低，且呈剂量依赖性(P<0.05)；TSRDN高剂量组和骨化三醇组作用相似，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 TSRDN对大鼠主动脉中Nrf2、HO-1、NQO-1、γ-GCS、RUNX2和BMP2 mRNA水平的影响

3 讨 论

CKD已成为与高发病率相关的全球主要健康问题，高磷酸盐血症被认为是CKD发病率和死亡率的预后因素〔12〕。在本研究中，用腺嘌呤加高磷诱导CKD的大鼠显示出典型的血管钙化及BUN和Scr水平的升高，Ca和P的异常水平，表明成功建立了高磷诱导的VC模型。高磷酸盐是动脉内侧钙化的关键因素。相关研究表明，血清磷酸盐水平升高在ESRD患者广泛的钙化动脉壁和软组织中起重要作用〔13〕。血管钙化可发生在内膜，中膜或两者中，钙化多见于较大动脉的大动脉粥样硬化斑块中。本研究在CKD大鼠中发现了血管内侧钙化，与其他报道〔14〕一致。本研究使用TSRDN治疗可显著改善肾功能和降低VC，并减弱成骨标记RUNX2 mRNA的表达，其效果与骨化三醇相当。临床上常采用维生素D制剂(骨化三醇)和钙补充剂来调控CKD患者的钙磷平衡，然而对晚期CKD患者疗效较差〔15〕。

研究表明，激活Nrf2/ARE信号通路可能是一种有前途的预防癌症进展的方法，同时Nrf2/ARE信号通路的激活可能通过促进VSMCs中的自噬来缓解高磷条件下的VC〔16〕。一项类似的研究表明，Nrf2抑制可以通过富马酸二甲酯促进VC，从而在过表达的Nrf2培养物中钙沉积被下调〔17〕。Nrf2/ARE通路控制着抗氧化剂和异源生物的抗氧化剂基因(如HO-1，γ-GCS，NQO-1和其他解毒酶基因)的表达，通过激活Nrf2/ARE调节基因可以抑制炎症反应，而这些基因的表达降低会导致自身免疫性疾病并增加对氧化损伤的炎症反应〔18〕。Nrf2活化药物可减轻炎症和氧化应激，诱导抗氧化剂基因的表达。二十二碳六烯酸(DHA)可以促进抗氧化酶的活化并改善Nrf2蛋白表达，从而促进自噬，而HO-1是Nrf2靶基因之一，可促进自噬并消除受损的线粒体，从而抑制脂多糖处理的大鼠肝脏中的氧化应激〔19〕。在靶向Nrf2的基因中，γ-GCS是合成谷胱甘肽(GSH)的重要调节剂，谷胱甘肽是最丰富的小分子抗氧化剂，可清除活性氧(ROS)并中和亲电试剂。γ-GCS的增加可以增强GSH的合成，从而提高组织和细胞的抗氧化能力〔20〕。此外，NQO-1在防止亲电试剂和反应性毒性方面的作用氧中间体〔21〕。本研究中发现TSRDN可以上调Nrf2、HO-1、NQO-1和γ-GCS mRNA表达，与上述研究一致。

本研究同时发现，TSRDN可以显著抑制RUNX2和BMP2 mRNA的表达，提示Nrf2/ARE信号通路的激活可能通过抑制成骨分化标记而抑制VC。VSMCs的成骨分化在钙化发展中起着重要作用，RUNX2是BMP2途径的主要靶蛋白，它是骨生成的调节剂，对调节骨特异性基因的表达至关重要〔22〕。相反，BMP2信号传导刺激p300介导的RUNX2乙酰化，从而增加反式激活活性并抑制Smad泛素调节因子(Smurf)1介导的RUNX2降解〔23〕。因此，可以看出这两种蛋白质在基因表达水平上彼此之间有很大的依赖性，证明BMP2/RUNX2信号通路中蛋白质的表达与VC的严重程度密切相关。研究还表明，Nrf2与ARE的结合过表达可能会干扰RUNX2及其下游靶标，从而影响细胞分化过程。此外，Nrf2通过抑制某些关键调节蛋白(例如RUNX2)抑制成骨细胞分化和矿化〔24〕。这与RUNX2缺乏抑制VC发生的平滑肌细胞有关。

综上所述，TSRDN能改善CKD大鼠肾功能和钙磷代谢，抑制VC，其机制可能与TSRDN激活Nrf2/ARE通路有关。由于VC发病机制复杂，对于TSRDN抑制VC的具体作用机制还有待进一步研究来论证。