基于网络药理学探讨补阳还五汤治疗特发性肺纤维化的生物学机制

宋思雨 丁露 李雅馨 王菁 魏莱 王子元 赵佳超 李香艳 王泽玉

(长春中医药大学 1中西医结合学院，吉林 长春 130117；2吉林省人参科学研究院;长春中医药大学 3附属医院肺病科；4中医学院)

To explore the biological mechanism of Buyang Huanwu Decoction on idiopathic pulmonary fibrosis based on network pharmacology

SONG Si-Yu，DING Lu，LI Ya-Xin，etal.

College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，Jilin，China

【Abstract】ObjectiveTo predict the potential targets and possible mechanisms of the Buyang Huanwu decoction (BYHWT) for the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) using a network pharmacology study, and to validate in vitro experiments by transforming growth factor (TGF)-β1-induced epithelial-mesenchymal transition (EMT) in alveolar epithelial cells A549.MethodsAccording to the principle of network pharmacology, the potential targets of BYHWT in the treatment of IPF were obtained.Cytoscape software drawing, STRING network platform and metascape database were used for protein interaction(PPI) network, gene ontology(GO) and kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG) enrichment analysis.TGF-β1-induced alveolar epithelial cells were used as the in vitro model.Experimental validation of network pharmacological prediction signaling pathway was carried out.ResultsThe network pharmacology predicted 168 potential targets of BYHWT for the treatment of IPF, and the signaling pathways associated with KEGG enrichment analysis were PI3K/AKT signaling pathway, nuclear transcription factor(NF) -κB signaling pathway, and FOXO signaling pathway. Cell experiment results showed that compared with the model group, BYHWT could significantly down-regulate the protein levels of p-Akt1/2/3 and phosphorylated NF-κB inhibitor protein (p-IκBα), and the gene expressions of EMT-related marker proteins type Ⅰ collagen(Coll)A1, snail and vimentin were significantly down-regulated at RNA level(P<0.05).ConclusionsBYHWT has the characteristics of multi-component, multi-target and multi-pathway to preventing and curing IPF, which plays a main role in the treatment of IPF by inhibiting the PI3K/Akt/NF-κB signaling pathway.

【Keywords】 Network pharmacology；Buyang Huanwu decoction；Idiopathic pulmonary fibrosis；Epithelial-mesenchymal transition；PI3K/AKT/NF-κB

特发性肺间质纤维化(IPF)是由不明原因引起的一种慢性、进行性、间质性的肺疾病〔1〕。该病的发病率和死亡率较高，目前仍缺乏有效的治疗手段〔2,3〕。尽管IPF的发病机制尚未清楚，但大量证据表明上皮间质转化(EMT)的发生是导致IPF的主要原因之一〔4,5〕。EMT的典型特征为α-平滑肌肌动蛋白(SMA)、锌指蛋白(Snail)、波形蛋白(Vimentin)上调〔1，6，7〕。转化生长因子(TGF)-β1是纤维化疾病中最有效的诱导剂之一，肺泡上皮细胞经TGF-β1刺激后能够向EMT转化〔8〕。

IPF在中医归属于“肺痿”“肺痹”等范畴，发病过程中“淤血”始终贯穿其中〔9〕。补阳还五汤(BYHWT)是益气活血的代表方，临床应用发现其对IPF的治疗有较好的效果。经现代药理学证实，BYHWT调控炎症因子的释放，抑制成纤维细胞增殖，干预EMT进程等〔10〕。但关于多成分多靶点的BYHWT治疗IPF具体机制的报道尚不明确。本实验采用网络药理学的方法筛选BYHWT治疗IPF的潜在靶点和通路，并探讨该方对A549人源肺泡上皮细胞的EMT作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 细胞 A549人源肺泡上皮细胞来源于中国科学院上海细胞生物研究所细胞库。药品与试剂：BYHWT药物组成为黄芪、当归尾、赤芍、川芎、桃仁、红花、地龙(长春中医药大学附属医院)〔11〕。RPMI1640培养基(Sigma，美国)；胎牛血清(Clark，美国)；胰蛋白酶、青链霉素混合液、磷酸缓冲盐溶液(BI，以色列)；TGF-β1(MCE，美国)；蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂(Roche，瑞士)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(碧云天)；p-Akt1/2/3、磷酸化NF-κB抑制蛋白(p-IκBα；Santa Cruz，美国)；SMA(CST，美国)；微管蛋白(Tubulin)(Proteintech，美国)二抗：羊抗兔、羊抗小鼠(Proteintech，美国)；总RNA提取试剂盒、cDNA反转录试剂盒、SuperReal荧光定量预混试剂增强版(天根)PCR引物(生工)。

1.2实验仪器 CO2培养箱(Esco，新加坡)；蛋白电泳仪、湿式转印槽、实时荧光定量PCR仪(Bio-red，美国)；倒置显微镜(Nikon，日本)；离心机(Eppendorf，德国)。

1.3BYHWT成分及靶点筛选 在TCMSP数据库，设置筛选条件为口服生物利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18和TCMID数据库收集BYHWT中黄芪、当归、赤芍、川芎、红花、地龙和桃仁的化学成分及相应的靶点，结合Swiss Target Prediction数据库对活性成分进行靶点预测，并将以上所获得靶点提交Uniprot蛋白数据库，获得相应的人源基因靶点的名称。

1.4IPF差异性表达基因的收集 利用GeneCards数据库检索IPF相关靶标与1.3所收集的靶点取交集对比，最终得到BYHWT治疗IPF的潜在作用靶点。

1.5蛋白互作PPI网络的构建 在线网站STRING上传1.4得交集结果，物种设定为“Homo sapiens”，最低互作分数为“Medium confidence(0.400)”，其余参数选择为默认值。

1.6核心靶点的京都基因与基因组百科全书(KEGG)与基因本体(GO)富集分析 设置条件 “Input as species：Homo sapiens，P<0.01”，在Metascape网站输入1.4交集靶点得到的Gene Symbol进行KEGG、生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞组分(CC)富集分析。

1.7BYHWT抗IPF体外验证实验

1.7.1BYHWT的制备 中药水煎液，将其过滤、离心取上清。经浓缩后，于真空干燥机中60℃烘干成粉末。使用时间，取10 mg复方粉末溶于10 ml PBS中，配制为1 mg/ml储备液。经0.22 μm滤膜后，置于4℃保存。

1.7.2细胞培养及分组干预 A549细胞培养于RPMI1640培养基(含10%胎牛血清、1%青链霉素混合液)。培养条件为：37℃，5%CO2的培养箱。设置对照组：完全培养基；模型组：5 ng/ml TGF-β1；治疗组：5 ng/ml TGF-β1，BYHWT：62.5 μg/ml，干预48 h〔11〕。

1.7.3Western印迹法检测相关蛋白表达 用放射免疫沉淀(RIPA)裂解缓冲液从A549细胞中提取总蛋白。运用BCA法定量蛋白。在8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE,30 μg)进行电泳分离各组样本中的蛋白并转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。室温环境下，用5%BSA-TBST溶液在摇床上封闭1 h。在4℃摇床中孵育一抗过夜。次日，用含0.05% Tween-20的TBS缓冲液在摇床上洗膜5次，5 min/次。室温中孵育1 h二抗。洗膜同上。用电化学发光(ECL)试剂盒对条带进行显色。使用以下一抗：p-Akt1/2/3(1∶500)，p-IκBα(1∶1 000)，α-SMA(1∶1 000)，Tubulin(1∶5 000)。

1.7.4qRT-PCR 收集细胞上清液，用PBS清洗两遍。按总RNA提取试剂盒的说明书操作：加入裂解液350 μl和10 μl Proteinase K，吹打消化细胞至板底干净。收集裂解液至1.5 ml离心管中至离心机中，以12 000 r/min、4℃离心5 min。取上清液加入基因组DNA去除柱中，12 000 r/min离心30 s，将所得滤液保留。将滤液中缓慢加入同等体积的70%乙醇，轻微混匀，转入RNase-Free吸附柱CR4中，12 000 r/min离心30 s，弃收集管中的废液。在CR4管中加入500 μl漂洗液RW，室温置2 min，12 000 r/min离心60 s，弃去废液，将CR4放回收集管中，重复两次。12 000 r/min离心2 min，弃掉废液。RNase-Free吸附柱CR4置于室温2 min，转移到一个新的RNase-Free离心管中，加入30 μl RNase-Free ddH2O溶解RNA，室温静置2 min，再以12 000 r/min离心2 min，获得RNA溶液。cDNA反转录试剂盒、PCR荧光定量试剂盒按试剂盒的流程操作。用2-ΔΔCT法进行定量计算。CollA1：上游引物：5′-TTCTGCAACATGGAGACTGG-3′，下游引物：5′-AATCCATCGGTCATGCTCTC-3′；Vimentin:上游引物：5′-GGACCAGCTAACCAACGACA-3′，下游引物：5′-AAGGTCAAGACGTGCCAGAG-3′;Snail:上游引物：5′-CTCGGACCTTCTCCCGAATG-3′；下游引物：5′-AAAGTCCTGTGGGGCTGATG-3′；GAPDH：上游引物：5′-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3′，下游引物：5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

1.8统计学方法 采用GraphPad Prism8软件进行单因素方差分析、Tukey-Kramer检验。

2 结 果

2.1BYHWT的有效成分及靶点预测 在TCMSP数据库收集BYHWT有效成分,将其与TCMID与Swiss Target Prediction搜集地龙成分及靶点删除重复值筛选出110个有效成分和348个靶点。

2.2BYHWT治疗IPF潜在作用靶点预测 依托GeneCards数据库获得治疗IPF潜在基因靶点3 054个,将筛选条件设置为“Relevance score≥4.56”，剩余1 531个靶点。将BYHWT活性成分的靶点与IPF靶点相匹配，获取潜在核心靶点168个。

2.3“疾病药物交集靶点-成分图”的网络分析 利用Cytoscape3.7.1作图软件构建BYHWT有效成分关键作用靶点网络图，分析BYHWT治疗IPF的机制。左侧圈代表活性成分作用的靶点，右侧圈代表活性成分(以Mol ID表示)，圈的大小代表度值(Degree)的高低。边代表活性成分和靶点的相互作用关系。图中一个节点的Degree值的含义是和该节点相连的节点数目。如果这个节点的Degree较大，说明这个节点在这个网络图中是枢纽作用，表明此点是关键的靶点或者化合物，见图1。

图1 疾病药物交集靶点-成分

2.4BYHWT治疗IPF关键作用靶点PPI网络 将168个关键靶点上传至STRING数据库，得到的PPI图。图中有节点168个、边3 646条、平均节点数43.4，见图2。

2.5核心靶点的GO富集分析和KEGG通路分析 在Metascape数据库，运用GO和KEGG对168个核心靶点进行分析。取BP、CC、MF前20排名结果，见图3。在BP中，炎症反应、细胞对化学应激的反应、对细菌源性分子的反应、活性氧代谢过程、对伤害的反应等排名靠前。在MF中，主要包括DNA结合转录因子结合、激酶结合、细胞因子受体结合、蛋白域特异性结合、磷酸酶结合等。在CC中，主要是膜筏、囊泡腔、细胞外基质、液泡等。

KEGG信号通路分析显示，癌症通路、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中、麻疹、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路、NF-κB 信号通路与168个核心靶点关系密切。

图2 BYWHT治疗IPF靶点PPI网络

2.6TGF-β1对A549细胞形态学影响 在倒置显微镜下观察各组细胞形态，对照组A549细胞48 h细胞的形态呈鹅卵石样，细胞大小均匀，没有突触或多角，贴壁状态良好。经TGF-β1刺激后细胞形态向梭形改变，圆形度明显降低，与成纤维细胞形态相似，见图4。

2.7BYHWT对EMT、PI3K/Akt/NF-κB标志蛋白影响 根据预测靶点的KEGG通路的富集结果显示，PI3K-Akt、NF-κB、FOXO信号通路排名靠前，对PI3K/Akt/NF-κB信号通路的标志蛋白进行体外实验验证。与模型组相比，治疗组下调EMT标志蛋白α-SMA和PI3K/Akt/NF-κB信号通路标志蛋白p-Akt1/2/3、p-IκBα水平，见表1。

图3 BYHWT抗IPF的KEGG、GO分析

表1 BYHWT对TGF-β1诱导A549细胞中α-SMA、 p-Akt1/2/3和p-IκBα蛋白表达的影响

2.8BYHWT对EMT相关mRNA影响 与对照组相比，TGF-β1促进了CollA1、Vimentin、Snail的mRNA表达(P<0.05)。经BYHWT干预后，Col1A1、Vimentin和Snail转录因子水平显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 BYHWT对TGF-β1诱导A549细胞中CollA1、 Vimentin和Snail基因表达的影响

3 讨 论

肺纤维化是一种慢性进行性呼吸性肺疾病，具有快速导致呼吸衰竭和高死亡率的特点〔12〕。IPF是肺纤维化中最常见的形式〔13〕。BYHWT始载于清代王清任所撰《医林改错》，方中重用黄芪补气通络，当归尾、川芎养血行气不伤本，地龙善于通经活络，赤芍、桃仁、红花助当归尾活血通络，使气旺血行以固本，散淤通络以治标，终得标本兼治。研究〔14〕发现，BYHWT治疗IPF的疗效不仅优于单纯的西药治疗，还能够改善患者的生活质量。有研究表明，经BYHWT干预后，IPF患者肺功能明显高于治疗前〔11〕。因此，BYHWT治疗IPF的作用机制亟待研究。本研究结果证明，在经BYHWT干预之后，A549人肺泡上皮细胞通过PI3K/Akt/NF-κB通路抑制EMT进程，发挥抗纤维化的作用。

槲皮素是一种自然界中广泛存在的黄酮类化合物。现代药理学研究表明，槲皮素具有抗纤维化、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理作用〔14〕。有研究发现，槲皮素能够通过多种途径发挥抗纤维化的作用〔15～17〕。木犀草素主要通过调控NLRP3/IL-1β/TGF-β1信号轴抑制SiO2诱导的矽肺纤维化〔18〕。这些活性成分的生物学功能从一定程度上证明了预测结果的可靠性。在PPI核心靶点中，TNF、Akt1、IL-6均被报道过参与肺纤维化病程〔16〕，推测BYHWT可能通过调控以上靶点发挥抗纤维化的作用。

KEGG通路富集结果显示，共得到300条通路，其中相关度较高的通路为癌症通路，与糖尿病相关AGE-RAGE信号通路，麻疹、PI3K-Akt信号通路、NF-κB和FOXO等信号通路相关。已有研究证明，抑制PI3K/Akt/mTOR或NF-κB信号通路能够缓解肺纤维化〔17,18〕。

综上，BYHWT通过降低p-Akt 1/2/3和p-IκBα的表达，抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路的激活和TGF-β1诱导A549细胞EMT的进程。这为BYWHT在临床应用提供了可能。