不同浓度臭氧处理对香椿贮藏期间非酶抗氧化性的影响

林少华，张慧杰，王细燕，纪海鹏,4，罗红霞,*，董成虎,*

（1.北京农业职业学院食品与生物工程系，北京 102442；2.北京大学现代农业研究院，北京 100080；3.天津市农业科学院农产品保鲜与加工技术研究所（国家农产品保鲜工程技术研究中心（天津）），农业农村部农产品贮藏保鲜重点实验室，天津市农产品采后生理与贮藏保鲜重点实验室，天津 300384；4.天津国嘉农产品保鲜生产力促进有限公司，天津 300384）

香椿（Toona sinensis）是一种在我国具有较大种植规模的木本蔬菜，不但营养丰富、风味独特，而且富含黄酮类、皂甙类、萜类和内酯类等活性成分，具有抗氧化、抗衰老、抗癌和抗病毒等保健功效[1-5]，深受广大消费者的喜爱。作为一种季节性非常明显的蔬菜，刚采摘的香椿嫩芽含水量高、呼吸旺盛、蒸腾作用强，极易腐烂变质，颜色也由紫红色衰变为深绿色，货架期极短，产业发展受到很大的限制[6-8]。

对比化学保鲜剂，臭氧保鲜具有使用后无污染、无残留等特点[9]。臭氧作为一种强氧化剂，不但能够减少果蔬表面微生物的污染，控制水分损失，抑制果蔬的呼吸和乙烯释放量[10]，而且可以激活果蔬体内的酶促和非酶促抗氧化系统，清除植物生理代谢产生的超氧阴离子和过氧化氢等会引起细胞损伤甚至死亡的活性氧[11-12]。在合适的处理浓度下，臭氧不会对果蔬的外观、质地或营养品质产生不利影响，并能有效地延长果蔬的贮藏时间[13]。但当臭氧处理浓度过高时会对果蔬造成损伤，反而加速它们的衰老和腐烂[14]。Lin等[8]研究表明，4.28 mg/m3的臭氧处理浓度可以延长香椿的贮藏时间，改善其生理生化指标，并抑制微生物的生长。但是该研究并未对不同的臭氧处理浓度进行筛选优化，亦未对臭氧处理如何影响采后香椿贮藏期间抗氧化系统进行分析。因此，本文将重点研究不同臭氧处理浓度对采后香椿贮藏期间抗氧化系统的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

香椿，采摘自北京市门头沟区雁翅镇苇子水村，3 h 内运送至国家农产品保鲜工程技术研究中心（天津）；聚乙烯（PE）膜，厚度0.02 mm，O2渗透率为2 860 cm3/（m2·24 h·0.1 MPa），CO2渗透率为9 400 cm3/（m2·24 h·0.1 MPa），透湿率为2.2 g/m2·d；碳酸钠、氢氧化钠、钼酸胺、草酸、乙酸、福林酚、乙二胺四乙酸、乙醇、亚硝酸钠等试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。INS-SH-0115F、INS-SH-0120F试剂盒，黄石市艾恩斯生物科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备

TU-1810 紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；HR/T20M 台式高速冷冻离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；PBI-200616-E 便携式气体测定仪，丹麦PBI-Dansensor 公司；精准控温保鲜库（±0.5 ℃，相对温度（RH）90%±5%），国家农产品保鲜工程技术研究中心（天津）监制；FA1004 电子天平，上海天平仪器厂；精准臭氧控制装置，国家农产品保鲜工程技术研究中心（天津）自制。

1.2 方法

1.2.1 处理方法

试验共设4 个处理，将经过挑选的新鲜、未损坏的香椿嫩芽随机分为4 组，每组含10 份，每份500 g，分为对照组（CK）：仅套上PE 保鲜袋；处理组1（T1）：在套上PE 保鲜袋的基础上，采用精准臭氧控制装置，每7 d 用4.28 mg/m3臭氧气体处理30 min；处理组2（T2）：在套上PE 保鲜袋的基础上，每7 d 用8.56 mg/m3臭氧气体处理30 min；处理组3（T3）：在套上PE 保鲜袋的基础上，每7 d 用12.84 mg/m3臭氧气体处理30 min。样品运抵实验室后即采样测定初值，并在4 ℃下预冷4 h 后开始贮藏。贮藏温度为（1±0.5）℃，RH 90%±5%。每10 d 采样测定各项指标，重复3 次，结果取平均值。

1.2.2 测定项目与方法

1.2.2.1 呼吸强度

采用静置法[15]进行测定。取100 g 香椿放于密封罐内静置2 h 后测定氧气和二氧化碳百分含量，然后计算得出。

1.2.2.2 可溶性蛋白含量

采用考马斯亮蓝染色法[16]进行测定。

1.2.2.3 VC 含量

采用钼蓝比色法[17]进行测定。

1.2.2.4 谷胱甘肽含量

采用比色法[18]进行测定。

1.2.2.5 总酚含量

采用福林酚法[19]，以没食子酸为标准品测定。

1.2.2.6 超氧阴离子含量

采用可见分光光度法[10]进行测定。

1.2.2.7 过氧化氢含量

参照Li 等[20]的方法进行测定。

1.2.2.8 总抗氧化能力

使用INS-SH-0115F 试剂盒进行测定。

1.2.2.9 总黄酮含量

采用硝酸铝显色法[21]，以芦丁为标准品测定。

1.2.2.10 花青素含量

采用INS-SH-0120F 试剂盒进行测定。

1.2.3 数据处理

使用SPSS 20.0 对数据进行LSD 差异显著性分析（P＜0.05 为差异显著，P＜0.01 为差异极显著），结果以±s 表示。

2 结果与分析

2.1 不同浓度臭氧处理对香椿呼吸强度的影响

果蔬采摘后光合作用即停止，呼吸作用是其生命活动获取能量的主要来源，对其采后生理及品质变化均具有重要调控作用[22]，其强弱能间接反映果实的衰老进程。Glowacz 等[13]研究发现，果蔬的呼吸作用随着其组织损伤强度的增加而增强。从图1 可以看出，各个处理组在第10 天时出现了呼吸低谷，然后开始呈现上升趋势，其中，T1 和T2 处理组差异不显著，但均显著低于CK 和T3 处理组（P＜0.05）。随着贮藏时间的延长，T2 处理组显著低于其他3 组（P＜0.05），而T3 处理组则显著高于其他3 组（P＜0.05），这说明合适浓度的臭氧处理可以抑制香椿的呼吸强度，但是臭氧处理浓度过高反而会促进香椿的呼吸作用，表明浓度为12.84 mg/m3的臭氧气体对香椿造成了损伤。

图1 不同浓度臭氧处理对香椿呼吸强度的影响Fig.1 Effects of different concentrations of ozone on respiratory intensity of Toona sinensis

2.2 不同浓度臭氧处理对香椿可溶性蛋白含量的影响

果蔬中的可溶性蛋白不但参与调控其生理生化的代谢过程，并且与果蔬的衰老变质密切相关[23]。从图2 可以看出，贮藏期间，4 个处理组香椿的可溶性蛋白含量呈下降趋势，但T1 和T2 处理组下降的趋势比CK 和T3 处理组缓慢，第20 天后，T1 和T2 处理组的可溶性蛋白含量显著高于CK 和T3 处理组（P＜0.05）。第20 天时，T2 处理组显著高于T1 处理组（P＜0.05），但在第30 天时两组差异不显著。李志巡等[24]的研究也表明，香椿可溶性蛋白含量随贮藏时间的延长而降低。此外，适宜浓度的臭氧处理可以延缓香椿可溶性蛋白含量的降低，但高浓度臭氧处理会导致香椿可溶性蛋白含量的快速减少。

图2 不同浓度臭氧处理对香椿可溶性蛋白含量的影响Fig.2 Effects of different concentrations of ozone on the content of soluble protein in Toona sinensis

2.3 不同浓度臭氧处理对香椿VC 含量的影响

VC 是评价果蔬贮藏品质的一个重要营养指标，也是十分重要的抗氧化物质，可与臭氧及其他活性氧发生反应，防止对果蔬造成损伤[25]。如图3 所示，贮藏期间香椿VC 含量呈现先上升后下降的趋势。贮藏到第10 天时，香椿VC 含量达到峰值，其中，臭氧处理组均显著低于对照组（P＜0.05），而且随着臭氧处理浓度的增加，香椿VC 含量降低。随着贮藏时间的延长，低浓度臭氧处理的香椿VC 含量与对照组的差距进一步缩小，贮藏至第30 天时差异不显著。

图3 不同浓度臭氧处理对香椿VC 含量的影响Fig.3 Effects of different concentrations of ozone on VC content of Toona sinensis

2.4 不同浓度臭氧处理对香椿谷胱甘肽含量的影响

从图4 可以看出，贮藏期间香椿谷胱甘肽含量的变化趋势与VC 含量变化趋势类似，也是先上升再下降。贮藏到第10 天时，香椿谷胱甘肽含量达到峰值，其中，T1 和T2 处理组显著高于对照组和T3 处理组（P＜0.05），过高浓度的臭氧处理会降低香椿谷胱甘肽的含量。该研究结果与Zhang 等[10]采用适当浓度臭氧处理草莓可促进其谷胱甘肽含量增加的结果类似。谷胱甘肽含量的高低直接影响了香椿抗氧化性的高低，因此，适宜浓度的臭氧处理可增强香椿的抗氧化能力。

图4 不同浓度臭氧处理对香椿谷胱甘肽含量的影响Fig.4 Effects of different concentrations of ozone on glutathione content of Toona sinensis

2.5 不同浓度臭氧处理对香椿总酚含量的影响酚类物质作为植物体内一种极为重要的次生代

谢产物，其累积水平受紫外线辐照、高光、创伤、营养不良、病原体侵袭等生物和非生物胁迫诱导的影响[26]。从图5 可以看出，T1 和T2 处理组香椿总酚含量在贮藏初期升高，而CK 和T3 处理组则降低，第10 天时T1 与T2 处理组差异不显著，但均显著高于CK 和T3处理组（P＜0.05）。随着贮藏时间的延长，4 个处理组的总酚含量均呈下降趋势。T1 和T2 处理组含有较高的多酚可能是因为适宜浓度的臭氧处理可以延缓其衰老，从而降低了多酚在抗衰老过程中的消耗，但高浓度臭氧处理导致的香椿损伤则加快了多酚物质的消耗。

图5 不同浓度臭氧处理对香椿总酚含量的影响Fig.5 Effects of different concentrations of ozone on total phenols content of Toona sinensis

2.6 不同浓度臭氧处理对香椿总黄酮含量的影响

黄酮类化合物是一类次生代谢产物，在植物中含量丰富，对自由基有很强的清除作用[27]。由图6 可知，香椿总黄酮含量在不同贮藏条件下总体呈下降趋势，其中，在第10 天时，T1 和T2 处理组显著高于T3处理组（P＜0.05）。贮藏至30 d 时，4 组间差异不显著。

2.7 不同浓度臭氧处理对香椿花青素含量的影响

花青素含量的变化是评判香椿贮藏效果的重要指标，也是其抗氧化体系的重要指标[13]。由图7 可以看出，香椿花青素含量在贮藏初期（0~10 d）基本保持稳定，但臭氧处理组显著高于对照组（P＜0.05）。随着贮藏时间的延长，香椿花青素含量出现断崖式下降，在30 d 时，T2 与T1 处理组香椿花青素含量差异不显著，但均显著高于CK 和T3 处理组（P＜0.05）。这可能是由于当臭氧浓度超过植物承受范围时，花青素与臭氧直接作用而发生氧化裂解。而适宜浓度的臭氧处理（如T2 处理）可以提升香椿花青素的合成，该结果与Chen 等[27]的研究结果类似。

图7 不同浓度臭氧处理对香椿花青素含量的影响Fig.7 Effects of different concentrations of ozone on anthocyanin content of Toona sinensis

2.8 不同浓度臭氧处理对香椿总抗氧化能力的影响

果蔬总抗氧化能力包括多种干扰自由基传播的物质，如VC、花青素、谷胱甘肽和多酚类等物质，它们共同组成的抗氧化活性物质都是活性氧的清除剂，保护细胞结构和生物大分子免受氧化损伤[13]。由图8 可知，整个贮藏过程中，T3 处理组香椿总抗氧化能力损失最大，显著低于T1 和T2 处理组（P＜0.05）。尽管臭氧具有强烈的氧化活性，但T1 和T2 处理组的香椿总抗氧化能力在第10 天与CK 处理组差异不显著，这可能是因为适宜浓度的臭氧处理引起的氧化应激在香椿中诱导了一些防御机制[25]。

图8 不同浓度臭氧处理对香椿总抗氧化能力的影响Fig.8 Effects of different concentrations of ozone on total antioxidant capacity of Toona sinensis

2.9 不同浓度臭氧处理对香椿活性氧含量的影响

活性氧主要是指超氧阴离子（O2·）和过氧化氢（H2O2）等物质，它们是植物生理代谢的产物，与植物的衰老劣变密切相关。

2.9.1 不同浓度臭氧处理对香椿超氧阴离子含量的影响

O2·经一系列反应最终会生成羟自由基（·OH），与植物体内的糖类、蛋白质、核酸及脂类等发生氧化损伤[28]。从图9 可以看出，臭氧处理组在香椿贮藏第10 天时抑制了超氧阴离子的产生，并显著低于CK 处理组（P＜0.05），T2 处理组又显著低于T1 和T3 处理组（P＜0.05）。随着贮藏时间的延长，超氧阴离子的含量在不断积累，第30 天时，T3 处理组显著高于其他3组（P＜0.05）。当超氧阴离子的产生超过香椿的氧化防御范围时，就会引起细胞损伤甚至死亡，从而导致其衰老腐烂。

图9 不同浓度臭氧处理对香椿超氧阴离子含量的影响Fig.9 Effects of different concentrations of ozone on superoxide anion content of Toona sinensis

2.9.2 不同浓度臭氧处理对香椿过氧化氢含量的影响

过氧化氢是化学性质较为稳定的活性氧种类，通常在植物体内以信号分子的形式发挥作用，高浓度的过氧化氢会破坏果蔬的细胞膜，导致脂质过氧化，并引起植物的氧化应激。降低活性氧含量是延长果蔬贮藏期并保持其营养品质的最有效方法之一[10]。由图10 可见，各试验组香椿过氧化氢含量总体呈上升趋势，但在贮藏初期（第10 天），T1 和T2 处理组抑制了过氧化氢的产生并显著低于CK 和T3 处理组（P＜0.05），高浓度臭氧处理组（T3）反而会加速过氧化氢的产生。贮藏至20 d 时，T2 处理组显著低于其他3 组（P＜0.05）。

图10 不同浓度臭氧处理对香椿过氧化氢含量的影响Fig.10 Effects of different concentrations of ozone on hydrogen peroxide content of Toona sinensis

3 结论

通过研究不同浓度臭氧处理对香椿贮藏过程中呼吸强度、非酶促抗氧化体系（可溶性蛋白、VC、谷胱甘肽、总酚、总黄酮和花青素的含量，以及总抗氧化能力）和活性氧含量（超氧阴离子和过氧化氢）的变化，结果表明，随贮藏时间延长，香椿呼吸强度、超氧阴离子和过氧化氢含量呈现出逐步上升的趋势，但非酶促抗氧化体系呈现逐步下降的趋势。臭氧浓度过高（12.84 mg/m3）时，将会导致香椿损伤，加速其衰老褐变。采用浓度为8.56 mg/m3的臭氧处理后，香椿的各项指标更优。