发酵处理对寿眉风味物质的影响研究

冯晓雪，薄佳慧，叶兴妹，肖力争*，朱海燕*

（1.湖南农业大学 园艺学院，国家植物功能成分利用工程技术研究中心，茶学教育部重点实验室，植物功能成分利用省部共建协同创新中心，湖南 长沙 410128；2.寿宁金花白茶科技有限公司，福建 宁德 352000）

白茶属轻发酵茶。根据原料等级不同，白茶分为白毫银针、白牡丹及寿眉3种。不同种类白茶滋味、香气、生物活性及商业价值均存在较大不同[1]。其中，寿眉原料较粗老，可采制时间长，年产量大，市场价值较低，运输及存储损耗大，易出现滞销等现象。因此，为推动茶产业结构进一步优化升级，茶行业提出六大茶类工艺相融合的制茶新思维，如微生物发酵技术不再局限于黑茶，逐渐应用于白茶、乌龙茶、红茶、云南晒青毛茶及普洱生茶等不同茶类的生产加工中，且经微生物发酵后的各类成品茶在保健功效方面的研究也取得一定进展[2-6]。金花白茶便是一种将茯砖茶（黑茶）微生物发酵技术应用于以寿眉为主的白茶再加工工艺的新产品，兼具白茶和茯砖茶风味。

现阶段，鲜有关于微生物发酵技术及发花工艺对白茶风味品质具体影响程度的研究，产品标准及生产标准尚未明确。故本研究以未陈放福建寿眉白茶为原料，采用喷洒茶汁渥堆发酵及手筑紧压等前处理方法对其进行烘房微生物发酵。采用理化成分检测及顶空固相微萃取-气相色谱质谱（headspace solid phase microextraction/gas chromatography-mass spectrometry，HSSPME/GC-MS）联用技术并结合感官审评对加工过程样品进行成分检测和分析，以期为探明白茶微生物定向发酵和发花技术提供数据支持，为提高金花白茶生物安全保障及发酵茶叶风味多元化提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

未陈放福建寿眉：福建白芽银仓茶叶有限公司，经湖南益阳冠隆誉黑茶发展有限公司加工制成金花白茶。取同一批寿眉原料到微生物发酵结束的加工阶段：原料（S1）、渥堆（S2）、烘房微生物发酵（S3）、烘房干燥即成品茶（S4）。微生物发酵过程实际包括从渥堆开始直至烘房干燥（S2～S4）3个阶段。

茚三酮、蒽酮、甲醇、福林酚、三氯化铝、氯化亚锡、浓硫酸、乙酸乙酯、草酸、碳酸氢钠、乙醇、正丁醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、甲醇、冰醋酸、甲酸（均为色谱级）：上海麦克林生化科技有限公司；AccQ.TagTM：沃特世科技（上海）有限公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（1260LC）：美国安捷伦公司；气相色谱-质谱联用仪（TRACE1310-ISQ）、HP-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、TriPlusTMRSH 自动进样器：美国赛默飞世尔科技公司；C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：美国旭日公司；数显恒温水浴锅（HH-2）：江南仪器厂；紫外可见分光光度计（UV2100）：上海尤尼柯仪器有限公司；固相微萃取装置（50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头）：美国Supelco公司；固相微萃取瓶（15 mL）：天津奥特赛斯公司。

1.3 方法

1.3.1 茶叶加工方法

以未陈放寿眉为原料，喷洒发花茶叶茶汁进行渥堆，时长24 h；渥堆结束后对茶叶进行高温汽蒸，使茶叶柔软方便压制不易碎；压制方法采用传统手筑压制，选用500 g茶砖模具；压制结束后将茶砖运送至恒温恒湿烘房进行发花，时长12 d；干燥工序同样在烘房中完成，时长8 d。

1.3.2 生化成分检测

茶多酚、游离氨基酸、水浸出物含量分别按照GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》、GB/T 8314—2013《茶游离氨基酸总量的测定》及GB/T 8305—2013《茶水浸出物测定》测定；可溶性糖含量及黄酮含量分别采用蒽酮硫酸比色法及三氯化铝法测定；咖啡碱、儿茶素组分、茶黄素及氨基酸组分均参考文献[7]进行，采用高效液相色谱法测定。

1.3.3 香气成分的萃取

称取磨碎均匀茶样1.00 g，放入15 mL萃取瓶中，加入10.00 μL正癸醇作为内标，对样品的质量进行监控和对比，后加入5 mL沸水和1.8 g氯化钠密封瓶口进行孵化。将TriPlusTMRSH自动进样器于60℃条件下平衡5 min，保证进样稳定性，并将萃取头在60℃条件下孵化50 min。

1.3.4 香气成分的解析

GC条件：HP-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；以高纯氦气（纯度＞99.999%）为载气，不分流进样，不分流时间1 min，流速1.3 mL/min，隔垫吹扫流速为5 mL/min；进样口温度250℃，吸附时间5 min。升温程序：起始温度为50℃，以8℃/min升至80℃，以2℃/min升至120℃，以5℃/min升至180℃，以10℃/min升至250℃，保持5 min。

MS条件：离子源为电子轰击源（electron impact，EI）；离子源温度250℃；电子能量70 eV；四极杆温度150℃；传输线温度250℃；质量扫描范围m/z：35～500。

1.3.5 数据处理及质谱检索

利用NIST标准谱库对GC-MS分析得到的色谱峰信息进行串联检索和人工解析，取相似度80%以上的挥发性成分进行定性分析。对所有的相对峰面积数据进行标准化处理，依据各香气成分峰面积归一化的方法确定其相对含量。

1.3.6 感官审评方法

由6名国家一级评茶技师组成审评小组，取代表性样品3.0 g，置于150 mL审评杯中，注满沸水，加盖浸泡5 min，滤出茶汤对茶汤及叶底香气进行品质评价及评分。总分=外形得分×25%+汤色得分×10%+香气得分×25%+滋味得分×30%+叶底得分×10%。

1.4 数据统计与分析

数据均采用3次重复试验的平均值，采用Excel 2019、GraphPad Prims 8.0.2、Tbtools及 SPSS 19.0 软件进行数据分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 发酵对寿眉感官品质影响

不同发酵阶段寿眉感官品质的变化见表1。

表1 不同发酵阶段寿眉感官品质的变化Table 1 Changes of sensory quality of Shoumei in different fermentation stages

由表1可知，白茶在微生物发酵过程中感官品质发生明显变化。外形方面，寿眉色泽呈现绿褐—深绿褐—黄褐色的变化趋势，S3及S4期间砖内金花普茂，达到良好的发花效果。随着微生物大量繁殖及多酚类物质氧化，汤色由黄亮逐渐加深为橙红明亮。白茶的清鲜感在渥堆后消失转变为甜香，经微生物发酵转变为以菌花香为主的香气品质。滋味方面，寿眉的鲜爽感和涩感在渥堆发酵过程中明显减弱，逐步向醇厚转变。叶底在整个过程中始终保持柔软状态，同干茶变化相似的是，叶底色泽同样由绿褐向黄褐色转变。总体而言，寿眉经渥堆发酵后风味品质已经发生较大改变，微生物发酵结束后兼具陈白茶及茯砖茶风味品质。茯砖茶发花工艺的引入明显改善了寿眉新茶较青涩的品质弊端，既保留了白茶的本质又赋予其独特的菌花香。

2.2 白茶微生物发酵过程中主要滋味物质的变化分析

2.2.1 发酵对寿眉儿茶素组分及茶多酚含量的影响

儿茶素包括酯型儿茶素和非酯型儿茶素，是茶多酚的最主要组成部分，与茶汤的苦涩味密切相关。研究表明，儿茶素在黑茶微生物发酵过程中会转化成多种物质[8]，导致儿茶素总量在微生物发酵过程中不断下降，茶多酚受儿茶素含量变化的影响同样呈明显下降趋势。不同发酵阶段寿眉儿茶素组分及茶多酚含量变化见图1。

图1 不同发酵阶段寿眉儿茶素组分及茶多酚含量变化Fig.1 Changes of catechin components and tea polyphenols content in Shoumei during different fermentation stages

如图1（a）所示，寿眉微生物发酵过程中除简单儿茶素EGC含量显著上升（整体增幅为26.35%），除GCG和EC降幅较小外，其余所有组分含量均显著下降。其中儿茶素组分中含量最丰富、活性最强的EGCG在发酵过程中极易水解生成没食子酸[9]等物质，其相对含量在发酵过程中减小幅度最为明显，由2.95%下降至0.65%。简单儿茶素总量（包括EGC、D-LC、EC）受EGC影响，生成量大于消耗量，总体略有上升，增幅为2.31%。呈涩味和强收敛性的酯型儿茶素总量（包括EGCG、GCG、ECG）受湿热和氧化作用的影响[10]下降显著，降幅达69.70%。寿眉经微生物发酵后简单儿茶素/酯型儿茶素的比值由0.21%显著上升至0.71%，增长幅度高达236.71%。该变化可能是寿眉口感由苦涩转为醇厚的重要原因[7]。

从图1（b）可以看出，寿眉微生物发酵期间茶多酚含量呈显著下降趋势（p＜0.05）。S1～S2期间茶多酚含量变化较小，差异性不显著，仅减少了3.67%；S2～S4期间茶多酚含量显著下降，S3和S4较前一阶段降幅分别为19.84%和6.49%。这是由于发酵过程促使冠突散囊菌大量繁殖，复杂多酚类物质受儿茶素水解、氧化及酶促反应的影响发生剧烈的降解反应。因此，S2～S3期间茶多酚含量降幅最大。酯型儿茶素、茶多酚含量的大幅下降以及简单儿茶素/酯型儿茶素比值的显著上升均有利于减轻寿眉新茶的青涩味，增强茶汤的醇厚度。

2.2.2 发酵对寿眉黄酮及茶黄素组分含量的影响

不同发酵阶段寿眉黄酮和茶黄素含量变化见图2。黄酮类物质主要由黄酮醇类和黄酮苷类物质组成，是茶叶苦涩味的主要来源之一[11]。如图2（a）所示，与之前的研究相同[3，7]，寿眉微生物发酵过程中黄酮总量整体呈波动上升趋势，整体增幅为5.92%。S1～S2期间黄酮总量上升了2.70%，之后到S3阶段快速下降了10.49%，这是由于黄酮类物质在微生物生长繁殖分泌的胞外酶和湿热作用下易发生水解[5]，冠突散囊菌生长越迅速，量级越大，因此对黄酮的酶促氧化作用越强。S3～S4期间，黄酮总量迅速上升至7.90%，增加了15.23%。这一结果与刘菲等[3]及薄佳慧等[7]关于白茶发花试验结果一致，但黄酮总量为何会在加工前后出现明显增长的机制及原因还尚未探明。未来需结合靶向代谢组学及酶活性等多种试验对该变化进行深入研究。

图2 不同发酵阶段寿眉黄酮和茶黄素含量变化Fig.2 Changes of flavonoids and theaflavins contents in Shoumei during different fermentation stages

研究表明，茶黄素（theaflavins，TFs）具有明显的护肝、抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、保护神经、保护皮肤、保护心脏、调节肠道微生物群和肾脏保护作用[12]，是影响茶汤强度、亮度和鲜爽度的关键物质之一。主要包括茶黄素双没食子酸酯（theaflavin 3，3′-di-O-gallate，TFDG）；茶黄素-3′-没食子酸酯（theaflavin3′-O-gallate，TF-3'G）；茶黄素-3-没食子酸酯（theaflavin 3-O-gallate，TF-3G）；茶黄素（theaflavin，TF）4 种单体。如图2（b）所示，4种茶黄素单体的含量在寿眉整个加工过程中均大幅下降，整体降幅分别为48.00%、66.04%、43.21%以及54.67%。S3～S4期间整体降幅均较小，差异性不显著。说明茶黄素含量可能与微生物发酵程度和冠突散囊菌的数量变化呈负相关。研究表明茶黄素与金花白茶滋味感官评分呈极显著负相关[7]，因此，茶黄素含量的下降有利于改善寿眉茶汤的口感。

2.2.3 发酵对寿眉游离氨基酸总量及氨基酸组分的影响

不同发酵阶段寿眉氨基酸组分的变化见表2。

表2 不同发酵阶段寿眉氨基酸组分的变化Table 2 Changes of amino acid composition of Shoumei in different fermentation stages

在微生物发酵过程中游离氨基酸是微生物繁殖的重要氮源和碳源，受酶的影响易发生脱羧及脱氨反应转化为其他物质；受茶叶温湿度影响，氨基酸会与其他多酚类、糖类物质及含羧基化合物发生美拉德或席夫碱缩合反应生成色素、生物碱等物质[10，13-14]。如表2所示，游离氨基酸经发酵后含量显著下降了24.91%。本次试验共测定出17种氨基酸组分，包括茶叶中特有且含量最丰富的茶氨酸，7种必需氨基酸和9种非必需氨基酸。微生物发酵后寿眉各氨基酸组分均出现不同程度下降，其中蛋氨酸含量变化较小，差异不显著；茶氨酸含量在整个过程中下降了28.87%，但占所测得17种氨基酸组分总量的比例上升了30.13%。必需氨基酸占非必需氨基酸的比例不断上升，由S1的36.56%显著上升至S4的54.80%。

2.2.4 发酵对其他滋味物质的影响

除了主要滋味物质（包括茶多酚、儿茶素、黄酮、茶黄素、氨基酸等），水浸出物、可溶性糖、咖啡碱及没食子酸（gallic acid，GA）同样对茶汤浓厚、甜醇口感的形成具有重要作用。发酵对其他主要滋味物质含量的影响见表3。

表3 发酵对其他主要滋味物质含量的影响Table 3 Effect of fermentation on the content of other main flavor substances

由表3可知，寿眉微生物发酵前后水浸出物和可溶性糖含量变化均较小，分别降低了6.26%和18.77%。水浸出物在发酵过程中会与茶多酚、咖啡碱和可溶性糖等形成络合物[15]，因此导致水浸出物在一定程度上有所减少。微生物发酵过程中冠突散囊菌会大量利用茶叶中的多糖类物质为碳源进行生长繁殖，同时氨基酸类物质开始与糖发生反应形成某些香气成分[16]，因而促使寿眉可溶性糖在渥堆阶段便开始被大量消耗。

寿眉于微生物发酵过程中，咖啡碱含量不断波动上升，增长了7.83%。S3阶段咖啡碱含量最高，这是由于咖啡碱含量的增加依赖于霉菌的生长[17]。S2～S3期间是冠突散囊菌大量繁殖的高峰阶段，因此咖啡碱含量随微生物发酵加深而显著上升[18]。GA是黑茶中含量最丰富的酚类化合物，同时也被认为是日本粉末绿茶中的一种增强鲜味的化合物[19]。该物质能够抑制人脑胶质瘤细胞活力、增殖、侵袭和血管生成[20]。寿眉经微生物发酵后，没食子酸含量增加幅度高达96.08%。这主要是由微生物发酵过程促进了单宁类物质水解[21]和酯型儿茶素快速降解[9]所致。

2.3 白茶微生物发酵过程中挥发性组分及相对含量的变化

茶叶中的芳香物质是决定茶叶品质的重要因子之一[22]。受茶树品种、鲜叶原料、栽培环境、加工工艺和贮藏环境等因素的影响，清香、鲜香、青香、嫩香、花香、陈香和菌花香等香气品质均可在白茶类产品中体现[7，23-24]。本研究采用HS-SPME法收集加工阶段茶样挥发性物质，并通过GC-MS技术鉴定出142种挥发性成分。其中醇类31种、酯类26种、碳氢类25种、酮类22种、醛类17种、酸类6种、酚醚类3种、杂环类物质5种以及其他7种物质。不同发酵阶段各类挥发性成分相对含量的变化见表4。

表4 不同发酵阶段各类挥发性成分相对含量的变化Table 4 Changes of relative contents of volatile components in different fermentation stages

醇类、酯类和杂环类物质含量在发酵过程中始终保持较高含量。研究表明，后发酵工艺可改变香气组分的含量，不同的后发酵时间可能会对香气组分产生不同的积累或消耗作用[25]。本研究所检测出的142种香气组分中44种具有明确的香气特征定性结果，结合相对定量分析，S4具有明确香气特征的物质贡献率比S1高10.83%，说明寿眉经过发酵过程可以丰富其香气及香型。发酵对加工中共有挥发性组分的影响见图3。

图3 发酵对加工中共有挥发性组分的影响Fig.3 Effect of fermentation on common-owned volatile components during process

如图3所示，142种挥发性物质中有31种存在于整个加工过程中。31种物质具有相同的变化趋势，其中15种在微生物发酵后相对含量显著增加（增幅1.22%～1 033.33%），分别为香叶醇（玫瑰花香）、呋喃型芳樟醇氧化物（木香花香及樟脑气息）、苯乙醇（弱玫瑰香）、苯甲醇（温和芳香，苦杏仁香）、水杨酸甲酯（冬青药草香）、橙花醇（玫瑰香）、咖啡碱、苯甲醛（杏仁气味）、α-松油醇、N-乙基琥珀酰亚胺（增幅达1 033.33%）、十四烷、十五烷、十六烷、醋氨酚、柏木脑（柏木香）。15种在微生物发酵后相对含量逐渐降低，分别为芳樟醇（花香）、β-紫罗酮（紫罗兰香，木香）、2，2，6-三甲基-6-乙烯基四氢-2H-呋喃-3-醇、β-环柠檬醛（清凉香和果香）、苯乙醛（甜花香）、A-紫罗兰酮（木质紫罗兰气味）、癸醛（强烈橘皮气味）、2，5-辛二酮、甲基庚烯酮（柠檬草气味）、γ-壬内酯（椰子香、果香）、2，4-二叔丁基苯酚、棕榈酸、棕榈酸甲酯、3-甲基十五烷、二氢猕猴桃内酯。植酮含量发酵前后均为0.16%。31种共有组分整体增加量（19.74%）高于减少量（12.41%）。

从以上各阶段共有挥发性成分相对含量的动态变化可以看出，微生物发酵后具有明确呈（清）凉香、花香及果香的香气组分含量显著降低了14.36%。明确呈木香、陈香、药香及苦杏仁香香气组分增加了89.54%。研究表明，芳樟醇、苯乙酮和水杨酸甲酯等是“菌花香”形成的关键香气成分[26]。表现为木香的醇类物质（如芳樟醇氧化物）对普洱生茶陈香品质有较好的协调作用，且陈香普洱茶水杨酸甲酯的含量显著高于普通普洱[27]。本研究中，S4较S1芳樟醇氧化物及水杨酸甲酯分别由6.90%和1.90%增加至7.26%和9.69%，水杨酸甲酯的增幅高达410%。结合感官审评，原料渥堆后清鲜感减弱，随着微生物发酵结束而完全消失，出现明显菌花香及陈香的香气特征。发酵对加工中非共有挥发性组分的影响见表5。

如表5所示，111种非共有挥发性成分受湿热环境及微生物分泌胞外酶的影响，发生复杂的变化。原料中含量较高的正己酸（汗臭味）、橙花基丙酮（清甜花香）、（E，E）-3，5-辛二烯-2-酮、正己醛、反式-2-己烯醛（清香和果香）在烘房微生物发酵过程中均未被检测出。其他相对含量较少且具有明确清香和花果香的物质[反式橙花叔醇（青香、花香）、辛醛（果香）、香橙醛（柠檬气味）、己酸己酯（青香，蜡香及果香）、（Z）-己酸-3-己烯酯（清香，果香）、丁位辛内酯（椰子香）、2-十一烯醛（柑橘香）、顺式-3-己烯醇苯甲酸酯（清气）、茉莉内酯（茉莉花香）、癸酸（不愉悦气味）、苯甲酸正己酯（木香河香脂香）、（-）-石竹烯氧化物（木香）、顺-3-己烯酸顺-3-己烯酯（青草气）]同样未在S3及S4样品中鉴定出。说明微生物发酵期间主要呈清香、青香和花果香的挥发性组分含量会大量降低。

表5 发酵对加工中非共有挥发性组分的影响Table 5 Effect of fermentation on uncommon-owned volatile components during process

续表5 发酵对加工中非共有挥发性组分的影响Continue table 5 Effect of fermentation on uncommon-owned volatile components during process

茯砖茶中代谢产物的转化主要是由生产过程中微生物分泌的微生物酶催化的[28]。因此推测寿眉在烘房进行微生物发酵时挥发性成分的相对含量和组成比例将会受微生物酶的影响而发生复杂变化。不同发酵阶段可能会对香气组分产生不同的积累或消耗作用。111种挥发性成分中37种挥发性物质仅在S3～S4期间被检测出。具有木香和樟脑香香气特征的反式芳樟醇氧化物（呋喃型）在S3及S4期间相对含量明显高于其他阶段，分别为10.88%和10.70%；具有木香香气的α-柏木烯在S3和S4阶段相对含量分别为0.07%和0.06%。此外，反-3-己烯醇、二氢2，2，6-三甲基-6-乙烯基-2H-吡喃-3（4H）-酮、顺-3-己烯-1-醇和2，4，4-三甲基-2-戊烯醛等物质在微生物发酵结束后相对含量较高，分别为1.58%、1.22%、4.4%和0.82%。这些变化对于改善寿眉粗老气及青气重的香气品质具有重要作用，同样对丰富白茶香型具有重要意义。

3 讨论与结论

本研究测定了寿眉在微生物发酵过程中的34种主要滋味物质（组分）和142种挥发性物质，同时对不同加工阶段样品进行了感官品质鉴定。感官审评结果表明，寿眉经渥堆发酵后滋味向醇厚带菌香转变，香气由清鲜带青气变为菌花香带陈香或药香，汤色由黄亮转化为橙红明亮，干茶及叶底色泽明显加深。主要滋味物质发生不同程度的变化，茶多酚、儿茶素、游离氨基酸和茶黄素含量显著降低；没食子酸含量显著增加；可溶性糖、水浸出物、黄酮及咖啡碱含量变化差异性不显著。故推测金花白茶的口感特征主要是在微生物发酵过程中形成的，在此过程中促使茶叶产生涩味、苦味和酸味的物质大大减少，改善了寿眉的滋味及汤色品质。

寿眉香气品质的改变是基于原料本身、渥堆发酵及烘房发酵期间冠突散囊菌大量繁殖促使茶叶代谢物发生系列变化所致。本次试验所鉴定出的142种挥发性成分中，醇类及杂环类物质始终保持较高含量，具有明确香气类型特征物质整体增加量高于减少量。其中31种成分为整个加工阶段所共有的物质。111种非共有成分中18种主要呈清香、青香或花果香的挥发性组分发生大量转化，仅在S1和S2期间被鉴定出，37种以花（木）香、陈香或药香为主的组分仅在S3和S4期间被鉴定出。总体来看，N-乙基琥珀酰亚胺、芳樟醇氧化物（呋喃型）、反式芳樟醇氧化物（呋喃型）、水杨酸甲酯、柏木脑、α-柏木烯、苯甲醇、β-环柠檬醛、苯乙醛、橙花醇、癸醛、甲基庚烯酮、苯甲醛及γ-壬内酯对于寿眉微生物发酵后菌花香和陈香品质的出现至关重要。

白茶微生物发酵过程中许多反应会同时发生。本次试验仅测定了部分常见化合物的动态变化，代谢产物的变化与微生物之间的关系尚未得到研究，黄酮类物质总量在干燥期间明显上升的原因仍不清晰。今后应结合代谢组学、微生物组学进一步深入发掘白茶微生物发酵过程中风味物质的变化机理，为金花白茶产业化发展提供更多可靠的数据支持。