黑老虎籽油化学成分、毒性与降脂活性研究

2022-06-23张湘龙凌智辉龙智博王旭军吴领席

中国粮油学报 2022年5期

张湘龙，凌智辉，龙智博，王旭军，吴领席，唐其，陆英

(湖南农业大学园艺学院1，长沙 410128) (林产可食资源安全与加工利用湖南省重点实验室2，长沙 410128) (怀化市通道侗族自治县农业农村局3，怀化 418500)

高脂血症是由脂质沉积或代谢异常而引发的一类代谢性疾病，是导致动脉粥样硬化以及冠状动脉基本的主要危险因素之一[1]，临床表现为血清中甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)升高以及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低[2]。目前治疗高脂血症最有效的方法是降低血液中血脂，市场上常用的一些降脂药物大多都是合成药物，通常存在一些副作用，近年来，具有预防和治疗高脂血症的天然产物因其副作用小越来越受到人们的青睐[3,4]。

黑老虎[Kadsuracoccinea(Lem.) A. C. Smith]是五味子科南五味子属(KadsuraKaempf.exJuss.)的常绿木质藤本野生植物，别名冷饭团、钻地风等，主要分布于湖南、广西等地，其根茎为民间药物，味辛、微苦、性温，具有行气止痛、散瘀活血的功效，常用于治疗风湿骨痛、跌打损伤、肠胃病及妇科病等[5]。现代研究表明，黑老虎中主要化学成分是三萜类和木脂素类化合物，其次还有倍半萜类、甾体类等成分[6,7]。黑老虎果实可食用，为聚合果，每颗果粒中一般含2～4颗种籽，占单颗果鲜质量的7%～15%。种籽由外种皮、内种皮及种仁组成，外种皮为薄层木质，易碎剥离，内种皮为褐色薄膜状，紧贴于种仁上，很难剥离。带有内种皮的黑老虎籽味道极苦，完全不能食用，因此除生产种苗外，一般作为废弃物丢弃。现黑老虎种籽水煮后可将内种皮去除，得到去苦味种仁。本研究采用压榨法制备去苦味和苦味油脂，测定其中主要成分含量，并研究油脂的长期毒性及降脂功能，旨在为黑老虎籽油开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1号油脂(去内种皮黑老虎籽榨油)、2号油脂(带内外种皮黑老虎籽榨油)、齐墩果酸(≥98%)、五味子酯甲(≥98%)、变色酸(分析纯)、37种脂肪酸甲酯混合标准品(≥99%)、二十一碳酸甲酯(≥98%)；无水甲醇、冰醋酸、香草醛、高氯酸、浓硫酸、异辛烷等均为分析纯；SPF级C57BL/6j小鼠(雄性，体重23～27 g);基础饲料和高脂饲料(配方为基础饲料中加入高脂、高糖、1.25%胆固醇和0.5%胆酸);总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度蛋白胆固醇(LDL-C)、总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)等试剂盒。

1.2 仪器与设备

GC-2010气相色谱仪，UVmini-1240紫外分光光度计，JB-P5包埋机，RM2016病理切片机，Nikon Eclipse E100正置光学显微镜，NIKON DS-U3成像系统，Epoch酶标检测仪，KZ-Ⅱ高速组织研磨仪。

1.3 方法

1.3.1 三萜含量测定

参考文献[8]中的方法。

1.3.2 木脂素含量测定

参考文献[9]中的方法。

1.3.3 脂肪酸含量测定

1.3.3.1 样品甲酯化处理

按GB 5009.168—2016方法。

1.3.3.2 脂肪酸含量测定

采用气相色谱仪测定脂肪酸含量，以37种脂肪酸甲酯标准品定性，内标法定量，样品中脂肪酸含量计算按照GB 5009.168—2016方法进行。

气相色谱条件：DB-WAX型毛细管柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)载气：N2；进样口温度：220 ℃，分流比10∶1；检测器温度：250 ℃，尾吹流量：25 mL/min；程序升温条件：初始温度75 ℃，以10 ℃/min升至165 ℃，保持1.5 min，以1.5 ℃/min升至185 ℃，保持5 min，以1.5 ℃/min升至195 ℃，保持5 min，以3.2 ℃/min升至240 ℃，保持8 min；柱流速：0.9 mL/min；进样量：1.0 μL。

1.3.4 黑老虎籽油食用油剂量长期毒性实验

根据人和动物的体表面积计算法、不同种类动物之间药物剂量换算法，小鼠灌胃剂量2、4、6 mL/kg换算成人的剂量为0.17、0.33、0.50 mL/kg。

1.3.4.1 灌胃药液制备

2种油脂分别取10 mL，加入0.5%羧甲基纤维素钠溶液，涡旋混匀，配制体积分数分别为0.05、0.1、0.15 mL/mL的混悬药液。

1.2.4.2 长期毒性实验方法

选用体重在23～27 g区间，等级为SPF的雄性小鼠80只，随机分成8只一组的10个小组，分别为1号油脂低、中、高剂量组、2号油脂低、中、高剂量组和空白对照组，实验前16 h禁止进食，然后每小组每天分别通过口灌胃给予不同体积分数的混悬药液0.8 mL，空白对照组给予相等量的纯水，连续28 d，观察毒性反应和恢复的时间、中毒特征及表现、体重发生的变化和其死亡情况等，记录样品体重发生的变化以及死亡情况。

1.3.5 黑老虎籽油功能性剂量降脂活性研究

根据人和动物的体表面积计算法、不同种类动物之间药物剂量换算法，小鼠的灌胃剂量150、300μL/kg换算成人的剂量为12.5、25 μL/kg。

1.3.5.1 动物分组与设计

42只SPF级小鼠饲喂基础饲料适应性喂养7 d后，根据体重随机分为6组，每组7只，分别为：正常对照组、高脂对照组、1号油脂低、高剂量组和3号油脂低、高剂量组，其中正常组和高脂组分别饲喂基础饲料和高脂饲料，同时10 mL/kg蒸馏水灌胃，其余各组在饲喂高脂饲料的同时采用灌胃方式给予低剂量(150 μL/kg)和高剂量(300 μL/kg)黑老虎籽油(使用0.5%CMC-Na稀释成与对照组相同的10 mL/kg剂量进行灌胃)。

1.3.5.2 动物实验及标本收集

实验期间小鼠分笼饲养，每笼7只，自由进食、饮水。每天定时灌胃，连续4周。末次灌胃后当晚禁饮食12 h，不限饮水，次日晨颈椎脱臼处死小鼠，眼球取血至非抗凝管中，放置1 h后4 000 r/min离心10 min取上层血清于-20 ℃冰箱保存；肝脏称重后放入-80 ℃超低温冰箱保存。

1.3.5.3 检测指标

测定小鼠脂体比、肝体比、血清脂质和抗氧化指标、动脉硬化指数、肝脏脂质和抗氧化指标及HE染色观察肝脏病理学变化。

1.3.6 统计分析

2 结果与分析

2.1 黑老虎籽油三萜、木脂素含量测定

两种黑老虎籽油中三萜、木脂素含量测定见表1，三萜含量在2种油脂中无较大差异，木脂素含量2号油脂高于1号油脂，约为1号油脂的1.6倍。

表1 黑老虎籽油中三萜、木脂素的质量分数(n=3)/%

2.2 脂肪酸含量测定

黑老虎籽油脂肪酸组分的质量分数见表2，由表2可知，1号和2号油脂中含有13种脂肪酸，其中5种为不饱和脂肪酸，分别占总脂肪酸的82.07%、82.41%，占油脂总质量的67.83%和51.56%；不饱和脂肪酸中又以亚油酸含量最高，占油脂总质量的59.70%、43.57%。

表2 黑老虎籽油脂肪酸组分的质量分数(g/100 g)

表3 黑老虎籽油对SPF小鼠体重及肝重的影响(n=8)

2.3 黑老虎籽油长期毒性实验

小鼠初次灌胃后的0～4 h，2号油脂中、高剂量组小鼠出现精神萎靡的症状，之后表现厌食，高剂量组第3天开始死亡，至第6天全部死亡；中剂量组于第4日开始死亡，至第8日全部死亡。其余各组未见明显异常。生存小鼠处死后解剖均没有发现积液和肿瘤，黑老虎籽油对SPF小鼠体重及肝重的影响见表3，样品组与空白体体重均无显著差异，1号油脂不同剂量组肝重与正常组无显著差异，2号油脂低剂量组肝重约为正常组的2倍，表现为肝脏异常肥大。

2.4 黑老虎籽油降脂活性研究

2.4.1 对高脂血症小鼠脂体比和肝体比的影响

如图1所示，与空白对照组相比，高脂对照组脂体比显著增加(P<0.05)，肝体比极显著增加(P<0.01)，表明造模成功；2种油脂低剂量组、高剂量组脂体比高脂对照组均显著下降(P<0.05)；1号油脂低、高剂量组和2号油脂低剂量组肝体比高脂对照组均显著下降(P<0.05)。

注：1为正常对照组，2为高脂对照组，3为1号油脂低剂量组，4为1号油脂高剂量组，5为2号油脂低剂量组，6为2号油脂高剂量组。与空白对照组相比，#P<0.05，##P<0.01；与高脂对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。下同。图1 黑老虎籽油对高脂血症小鼠脂体比和肝体比的影响

2.4.2 对高脂血症小鼠血清抗氧化指标的影响

由图2可看出，高脂对照组小鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)极显著低于空白对照组(P<0.01)；与高脂对照组相比，1号油脂两种剂量SOD和T-AOC均极显著增加(P<0.01)，2号油脂低剂量组SOD和T-AOC均极显著增加(P<0.01)，2号油脂高剂量组SOD显著增加(P<0.05)，T-AOC极显著增加(P<0.01)。

图2 黑老虎籽油对高脂血症小鼠血清抗氧化指标的影响

2.4.3 对高脂血症小鼠血清脂质水平的影响

如图3所示，与空白对照组相比，高脂对照组小鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL-C)极显著增加(P<0.01)，高密度脂蛋白(HDL-C)极显著降低(P<0.01)；与高脂对照组相比，1号油脂低、高剂量组TC、TG和LDL-C均极显著降低(P<0.01)，HDL-C 显著或极显著增加(P<0.05，P<0.01)；2号油脂低剂量组TC显著降低(P<0.05)，低剂量组和高剂量组TG、LDL-C均极显著降低(P<0.01)，HDL-C 显著增加(P<0.05)。

图3 黑老虎籽油对高脂血症小鼠血清脂质水平影响

2.4.4 对高脂血症小鼠动脉粥样硬化指数(AI)的影响

由图4可看出，高脂对照组AI值极显著高于空白对照组(P<0.01)；与高脂对照组相比，1号油脂高剂量组AI值显著降低(P<0.05)；1号油脂低剂量组和2号油脂低、高剂量组均极显著降低(P<0.01)。

图4 黑老虎籽油对高脂血症小鼠AI值的影响

2.4.5 黑老虎籽油对高脂血症小鼠肝脏脂质水平的影响

由图5可看出，与空白对照组相比，高脂对照组肝脏组织TC、TG极显著增加(P<0.01)；与高脂对照组相比，1号油脂低、高剂量组TC水平极显著降低(P<0.01)，2号油脂低剂量组显著降低(P<0.05)；2种油脂低、高剂量组TG水平均极显著降低(P<0.01)。

图5 黑老虎籽油对高脂血症小鼠肝脏脂质水平的影响

2.4.6 对高脂血症小鼠肝脏抗氧化指标的影响

由图6可看出，与空白对照组相比，高脂对照组小鼠肝脏SOD显著降低(P<0.05)；与高脂对照组相比，1号油脂两种剂量和2号油脂低剂量组SOD和T-AOC水平均显著增加(P<0.05)；2号油脂高剂量组SOD显著增加(P<0.05)，T-AOC极显著增加(P<0.01)。与空白对照组相比，高脂对照组丙二醛(MDA)含量增高，但无统计学意义；与高脂对照组相比，2种油脂各剂量组均有一定降低(约15.5%～20.0%)，也无统计学意义。与空白对照组相比，高脂对照组谷胱甘肽(GSH)显著降低(P<0.05)，2种油脂不同剂量组有一定增加，但无统计学意义(P>0.05)。

图6 黑老虎籽油对高脂血症小鼠肝脏抗氧化指标的影响

2.4.7 黑老虎籽油对小鼠肝脏变化的影响

2.4.7.1 肉眼观察肝脏一般形态

各组小鼠解剖后观察肝脏外观形态，空白对照组肝脏色泽鲜艳，呈鲜红色，无病变现象。高脂对照组肝脏肿大，呈灰白色脂肪性变，是典型的脂肪肝。与高脂对照组相比，1号油脂低、高剂量组和2号油脂低剂量组肝脏颜色呈红色，大小正常，与对照组比较有所改善；2号油脂高剂量组肝脏肿大，色泽呈灰白色，与模型组比较无明显改善。

2.4.7.2 HE染色肝脏组织病理学观察

小鼠肝脏组织HE染色图如图7所示，空白对照组小鼠肝细胞大小均匀，排列整齐，形态正常，无明显的脂肪变性；与空白对照组相比，高脂对照组肝细胞肿胀，胞质稀疏，细胞核偏离中心，肝索排列紊乱，细胞内与胞间有较多脂滴空泡，充满大小不等的脂肪滴；与高脂对照组相比，1号油脂低、高剂量组和2号油脂低剂量组细胞间隙与细胞体积明显变小，脂肪空泡减少。2号油脂高剂量较高脂对照组症状稍有改善，但相较其他3组效果不明显。说明低、高剂量1号油脂和低剂量2号油脂对小鼠高脂血症有一定预防作用。

图7 小鼠肝脏组织HE染色图(10x)

3 讨论

通过化学成分含量检测发现1号油脂中木脂素类化合物明显低于2号油脂，三萜含量相近；1号油脂中脂肪酸、不饱和脂肪酸总量和亚油酸含量明显高于2号油脂，但不饱和脂肪酸总量占脂肪酸总量的比例相同。由此推测油籽的苦味主要来源种皮中的木脂素类化合物。

以食用油剂量对黑老虎籽油进行长期毒性研究，发现2号油脂低剂量组小鼠肝脏肥大，中、高剂量组小鼠死亡。五味子木脂素中一些化学成分对哺乳动物细胞具有一定毒性，其中五味子乙素在小剂量使用时起保护治疗作用，而大剂量使用反而会增加血液和肝脏的脂质水平[10-14]；同时，2号油脂味道极苦，可能使小鼠产生厌食症状，导致食欲不振，因此，推测2号油脂低剂量组致小鼠肝脏肥大可能是大剂量木脂素所导致，中、高剂量组小鼠死亡可能也是由于木脂素毒性，再加上厌食原因所致。

以功能性油脂剂量对黑老虎籽油进行降脂功效研究，结果表明1号油脂和低剂量2号油脂均具有显著的降脂作用，这与黑老虎籽油中亚油酸及不饱和脂肪酸含量较高有关，亚油酸具有降脂、预防动脉粥样硬化、参与脂肪分解与新陈代谢、增强肌体免疫能力等重要生理功能[15-20]。2号油脂降脂作用弱于1号油脂，可能是因为2号油脂中亚油酸及不饱和脂肪酸总量均低于1号油脂；同时，也是由于2号油脂中木脂素含量高于1号油脂，大剂量使用反而会增加血液和肝脏的脂质水平。