N6-甲基腺苷修饰在HBV感染中的作用

薛 萍， 范 超

空军军医大学第二附属医院 传染科， 西安 710038

RNA转录后修饰在真核生物中较为普遍。其中，N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)修饰的生物学作用逐渐受到重视[1]。据估计[2]，细胞中25%的mRNA存在m6A修饰。而长链非编码RNA(lncRNA)、微小RNA(miRNA)和病毒转录产物等RNA分子中也存在m6A修饰现象。自1970年起，RNA分子中的m6A甲基化现象被陆续发现，当时的m6A检测主要依靠水解或核酸酶消化放射性标记的RNA和色谱分析。时至今日，MeRIP-seq、PA-m6A-seq、miCLIP、m6A-LAIC-seq和SELECT等技术陆续被开发，使m6A功能相关研究得以更全面地开展[3-7]。

m6A修饰既有普遍性，又有序列特异性。多数m6A位点修饰以相似的分布方式存在于相应的mRNA中，主要发生在RRACH基序(R=A或G；H=A、C或U)上，位点常聚集在转录起始点、剪接位点侧翼的外显子区、终止位点、5′非翻译区(5′UTR)和3′非翻译区(3′UTR)附近。基因的功能常与m6A丰度相关，例如调节发育和细胞命运的基因往往含有更高的m6A修饰[5]。其功能涉及：RNA的稳定性、剪接、核输出、折叠、翻译调节和降解等；参与的生物学过程包括：细胞重编程、干细胞分化、细胞增殖、细胞的应激反应、昼夜节律的调控和癌症的发生等[8]。

m6A修饰不仅存在于真核细胞的内源性RNA中，也同样存在于病毒基因转录本中。例如猿猴病毒40、甲型流感病毒和腺病毒等的mRNA中均存在m6A修饰[9]。研究[10-11]发现，HBV感染同样受到m6A修饰的调节。使用siRNA基因沉默m6A甲基转移酶——甲基转移酶样蛋白(methyltransferase-like protein，METTL)3/14可促进HBc和HBs的表达。同样，如果基因沉默m6A结合蛋白YTHDF2/3，也会得到相似的结果。相反，如果基因沉默m6A去除蛋白FTO和ALKBH5，则会抑制HBc和HBs等病毒蛋白的表达[12]。

1 m6A修饰的基本过程和参与蛋白

m6A修饰的基本过程包括m6A的写入、擦除和识别。m6A修饰受三类蛋白的调节，即甲基转移酶(或称“写入器”)、去甲基化酶(或称“擦除器”)以及m6A结合蛋白(或称“读取器”)。m6A修饰由甲基转移酶引入，可被去甲基化酶消除，并通过m6A结合蛋白调节RNA的结构和功能(图1)。“写入器”由METTL3/14/16、维尔姆斯肿瘤相关蛋白(Wilms tumor associated protein，WTAP)、RNA结合基序蛋白15和KIAA1429等亚基构成[13]。METTL3/14为复合物的核心成分，WTAP为调节亚基。RNA结合基序蛋白15和KIAA1429等蛋白也可影响“写入器”的活性[14]。METTL16独立于METTL3/METTL14/WTAP复合物，介导U6 snRNA和甲硫氨酸腺苷转移酶2A mRNA的m6A修饰[15-16]。m6A修饰位点产生后，可通过alkB同源物5或脂肪量和肥胖相关蛋白等去除。脂肪量和肥胖相关蛋白除对m6A修饰具有去除作用外，还参与单链DNA或RNA中3-甲基胸腺嘧啶或3-甲基尿嘧啶的去甲基化[14]，并可介导N6,2′-O-二甲基腺苷(m6Am)的去除[15]。m6A“读取器”的成员包含：YTH家族蛋白1/2/3(YTH domain family protein1/2/3，YTHDF1/2/3)、YTH结构相关蛋白(YTH domain containing1/2，YTHDC1/2)等。YTHDF1可通过与3′UTR区域的m6A位点结合增强mRNA的翻译活性；YTHDF2招募CCR4-NOT复合蛋白来促进mRNA的降解；YTHDF3为YTHDF1和YTHDF2调节亚基[17-18]。YTHDC1可调节mRNA从细胞核到细胞质的运输[19]，YTHDC2可与细胞质中的核糖体亚基相互作用，调节RNA的翻译[19]。此外，广义的m6A“读取器”还包括胰岛素样生长因子2-mRNA结合蛋白(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein，IGF2BP)和真核起始因子3(eukaryotic initiation factor 3，eIF3)等[20]。IGF2BP通过GG(m6A)C基序与m6A位点结合，以促进mRNA的稳定性；eIF3通过与mRNA 5’UTR 区的m6A位点结合来促进蛋白质翻译[20]。

2 HBV转录物的m6A修饰

在HBV的复制周期中，HBV可转录产生前基因组RNA(pregenomic RNA，pgRNA)，后者在细胞质核心颗粒中被逆转录为松弛的环状DNA，随后环状DNA在细胞核中转化为共价闭环DNA，并利用细胞RNA聚合酶Ⅱ合成病毒RNA[21]。HBV基因转录从不同的转录起始位点开始，但共用同一个转录终止信号。因此，HBV转录本具有不同的5′末端，但具有共同的3′末端序列[22]。HBV转录产物中包含m6A共有的DRACH基序(GGACA)，位于HBV转录物的epsilon-茎环区域(A1907)内。由于HBV基因存在冗余重复，该基序在pgRNA的5′和3′末端重复2次，但在亚基因组转录本的3′UTR中仅存在1次[23]。这些m6A修饰位点可被“阅读器”识别并促进HBV RNA的细胞质转运和pgRNA包装。在YTHDC1敲除细胞中，病毒转录物在细胞核中积累，病毒复制和共价闭环DNA合成受到显著抑制。

HBV RNA不同位置的m6A修饰具有不同的生物学功能。位于HBV转录本3′-epsilon茎环的m6A修饰可降低病毒转录物的稳定性，从而抑制病毒蛋白的表达。这种RNA稳定性的降低由YTHDF2/3介导。因此，基因沉默这些蛋白可增强HBV蛋白表达。同样，当3′-epsilon茎环m6A位点发生突变时，HBV蛋白的表达也被会增强。另一方面，位于pgRNA 5′-epsilon茎环中的m6A位点则可通过促进逆转录酶的识别，正向调节病毒的逆转录活性[10]。同时，由于pgRNA 5′-epsilon茎环结构可被视黄酸诱导基因Ⅰ(retinoic acid inducible gene Ⅰ，RIG-Ⅰ)识别，从而刺激干扰素(IFN)合成。而m6A修饰的存在可以降低RIG-Ⅰ的亲和力[24]。因此，HBV RNA的m6A 修饰可作为降低RIG-Ⅰ识别自身与非自身RNA的一种特殊手段。

3 m6A参与HBV感染免疫应答

HBV RNA的m6A修饰可调节宿主的免疫应答过程。HBV RNA的m6A修饰在IFNα诱导的病毒RNA降解中发挥作用，YTHDF2作为识别因子介导HBV RNA的降解[28]。在HBV感染的IFN治疗过程中，IFNα通过IFN刺激基因20(interferon stimulating gene，ISG20)的核酸外切酶活性降解病毒RNA[25]。研究[26]发现，ISG20可被YTHDF2识别。YTHDF2将ISG20递送至HBV RNA的m6A甲基化位点，从而对病毒RNA进行降解。相反，如果突变HBV RNA的m6A位点，则ISG20介导的病毒RNA降解过程会被削弱[25-26]。病毒感染激活宿主模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)可检测病原体相关分子模式，启动固有免疫反应对抗病毒感染。而识别外来RNA的PRR依赖于特定的分子特征来区分自身与非自身RNA。如前所述，HBV pgRNA 5′-epsilon茎环上的m6A修饰降低了RIG-Ⅰ的信号活性，抑制RIG-Ⅰ对病毒RNA的识别过程[24]。同时，由于m6A修饰位点的存在，YTHDF2可与HBV RNA的RIG-Ⅰ配体识别区结合，进一步阻断RIG-Ⅰ信号转导。因此，YTHDF2通过将病毒RNA与RIG-Ⅰ隔离来抑制RIG-Ⅰ对HBV RNA的感知[22]。

4 HBV感染对m6A修饰的影响

HBV感染可诱导宿主细胞m6A修饰谱发生显著变化[27]。例如，磷酸酶和张力蛋白同源蛋白(phosphatase and tesion homologue deleted on chromosome ten，PTEN)的转录产物在HBV感染过程中表现出异常的m6A修饰，这种修饰可降低PTEN的稳定性，减少PTEN的表达水平。PTEN可通过诱导干扰素调节因子3(interferon regulatory factor，IRF-3)的 Ser-96磷酸化促进IRF-3核转位，从而激活IFN信号[28]。因此，HBV上调PTEN的m6A修饰过程抑制了宿主的抗病毒免疫反应[27]。HBV可利用特殊机制指导自身RNA的m6A修饰[29]。例如，HBx可通过调节病毒RNA的m6A修饰影响病毒的感染周期。在HBV感染期间，HBx可与m6A甲基转移酶相互作用，促进其核转移过程，从而增强m6A甲基转移酶对HBV转录产物的m6A修饰作用。因此，HBx缺陷型的HBV感染不能有效产生m6A修饰的病毒RNA[29]，进而阻断SMC5/6复合物的激活和HBx-DDB介导的RNA降解活性[30]。HBx还可促进m6A甲基转移酶向PTEN基因的募集，从而将m6A添加到PTEN转录本中[27]。

图1 m6A修饰的基本过程和参与蛋白

5 m6A修饰与HBV相关肝细胞癌(HCC)

HBV慢性感染是HCC的最主要原因[10,31]，越来越多的证据[35-36]表明，m6A相关蛋白的异常表达与HCC相关。例如，m6A修饰可通过METTL3/14参与HCC进程。HCC中异常表达的METTL3促进HCC的细胞增殖、迁移和集落形成[32]。细胞因子信号抑制因子2(suppressor of cytokine signaling 2，SOCS2)是METTL3介导的m6A修饰的靶基因，METTL3可通过YTHDF2介导的m6A识别促进SOCS2 mRNA的降解，从而使细胞失去SOCS2相关的抑癌信号。另一方面，METTL14在HCC中显著下调，其表达水平与肿瘤复发和生存预后相关。METTL14通过促进DiGeorge综合征相关结构域基因8与miRNA初级转录产物(pri-miR)的识别，调节pri-miR126向miR126的成熟，最终促进肿瘤分化和微血管浸润[9]。此外，HBV感染调节PTEN的m6A甲基化，减少PTEN表达。PTEN是一种重要的肿瘤抑制蛋白[33]，PTEN水平降低将在一定程度上诱导HCC的发生[34]。HBx诱导circ-ARL3的m6A修饰有利于circ-ARL3反向剪接和生物发生，circ-ARL3能够吸附miR-1305，拮抗癌基因作用，从而促进HBV相关HCC进展[35](图2)。

6 小结与展望

病毒基因组及转录物的m6A修饰与病毒的发病机制密切相关[10,36-38]。本文讨论了HBV感染过程中发现的m6A修饰，这些研究结果为了解m6A在病毒-宿主相互作用中的功能提供了新的证据，也可能为基于m6A的治疗干预提供新的途径，但依然有很多问题值得进一步研究。近期，本实验室通过收集不同HBV感染者临床样本开展m6A修饰谱分析，发现不同HBV感染者间的细胞m6A修饰存在明显差异，表明m6A修饰可能对HBV感染免疫应答具有重要意义，其具体机制将在后续研究中深入讨论。作为一种具有应用前景的分子靶点，m6A是否可以成为HBV预后和诊断标志物，以及在药物筛选中的潜力依然有待发掘。同时，还应注意到，除了m6A修饰外，病毒转录本还存在其他化学修饰，包括5-甲基胞嘧啶、尿苷向假尿苷的编辑以及腺苷到肌苷的编辑等[39]；而在病毒基因组中也报道了其他形式的表观转录组修饰，包括5-甲基胞苷、N4-乙酰胞苷，但上述修饰的具体功能依然有待研究[39-40]。相关RNA修饰的机制和功能是否类似m6A修饰，对该问题的深入分析具有重要的生物学意义。

图2 HBV感染过程中m6A甲基化的调控作用

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：薛萍负责收集数据，资料分析，撰写论文；范超负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。