多天线N-糖链对双表型肝细胞癌的辅助诊断价值

冯惠娟， 张 宇， 卓传尚， 黄晨军， 房 萌， 柳丽娟

1 福建医科大学孟超肝胆医院 检验科， 福州 350025； 2 上海东方肝胆外科医院 实验诊断科, 上海 200438

双表型肝细胞癌(dual-phenotype hepatocellular carcinoma，DPHCC)是2011年首次被报道的肝细胞癌(HCC)的一种新亚型，其发生率约占HCC的10%[1-2]。研究[2]发现，DPHCC患者在性别、年龄、HBV感染、血清甲胎蛋白(AFP)含量、临床分期等方面与HCC患者无明显差异，但DPHCC患者微血管侵犯及肝内外转移的发生率较HCC发生率更高，临床预后更差，复发风险也更高。因此DPHCC的精细分型对于HCC患者的精准治疗及提高临床对HCC亚型的认识具有重要意义。

目前，DPHCC的诊断主要依赖于免疫组化检查，其组织病理学表现为典型的HCC特点，而免疫表型则具有HCC和肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)的双重特性。当肿瘤表现为单一的HCC组织学成分，同时表达任意HCC蛋白标志物(如AFP、HepPar-1、pCEA等)和ICC蛋白标志物(如 CK19、CK7、CA19-9等)的癌细胞数量>15%时，即可诊断为 DPHCC[3]。免疫组化为诊断DPHCC的金标准。目前常用的DPHCC血清学检测指标有AFP、异常凝血酶原(PIVKA-Ⅱ)、癌胚抗原(CEA)及糖类抗原19-9 (CA19-9)四项，主要为HCC与ICC的辅助诊断指标，尚无特异性DPHCC的血清学指标，因此，需要寻找新的血清学指标用于DPHCC辅助诊断指标。

肝脏参与了血清中近 50%糖蛋白中N-糖链的形成。N-糖链根据天线(或分支)的数量可分为二天线、三天线、四天线及四天线以上N-糖链结构，其中三天线、四天线及四天线以上N-糖链结构称为多天线N-糖链结构(Multi-glycan)[4]。研究[5]发现血清N-糖链表达水平(量)与糖链结构(质)的改变可以成为HCC潜在诊断标志物或治疗靶标，特别是血清中Multi-glycan表达水平的变化与肿瘤的复发、转移等密切相关。Huang等[6]研究发现，HCC患者血清三天线N-糖链结构丰度显著增加，同时复发患者三天线及四天线丰度显著增加，部分复发患者甚至出现四天线以上N-糖链结构，Multi-glycan可以作为HCC患者复发的潜在标志物之一。对于复发风险更高的DPHCC而言，患者血清中Multi-glycan的表达情况目前尚无相关文献报道。因此，本研究拟通过比较DPHCC中常见血清肿瘤指标与Multi-glycan的表达，探讨Multi-glycan对DPHCC的辅助诊断价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2019年6月—2020年 12月福建医科大学孟超肝胆医院220例患者血清，分为DPHCC组、HCC组和肝硬化组。收集所有患者的一般临床资料、实验室检测资料及病理资料。HCC诊断依据《原发性肝癌诊疗规范(2017年版)》[7]。DPHCC诊断依据《原发性肝癌诊疗规范(2019年版)》[8]。LC诊断依据《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[9]。

1.2 纳入及排除标准

1.2.1 HCC及DPHCC组 HCC及DPHCC均为经术后病理检查明确诊断。排除标准：(1)继发性肝癌、其他器官恶性肿瘤、严重感染及其他器官严重疾病等；(2) HBV之外的其他病毒感染，如HAV、HCV等；(3)其他慢性肝病引起的肝癌，如：酒精性脂肪肝、自身免疫性肝病等。

1.2.2 LC组 LC均经过临床表现和影像学检查确诊。排除标准：(1)HBV之外的其他病毒感染，如HAV、HCV等；(2)其他原因引起的肝硬化，如原发性胆汁性肝硬化、酒精性肝硬化、血吸虫肝硬化等。

1.3 检测方法 采用基于DNA测序仪的荧光毛细管电泳(DNA sequence-assisted fluorophore-assisted capillary electrophoresis, DSA-FACE)技术，通过N-糖链释放、荧光标记、去除唾液酸及测序仪检测四个步骤，进行N-糖链结构分析检测，具体操作步骤见参考文献[10]。

1.4 实验室常规指标检测 收集所有对象的实验室检测资料，包括AFP、PIVKA-Ⅱ、CEA、CA19-9、TP、Alb、TBil、ALT及AST。其中AFP、PIVKA-Ⅱ、CEA 及CA19-9四项均采用LLMIPULSEG1200全自动化学发光仪(日本富士公司)及配套试剂检测。TP、Alb、TBil、ALT及AST五项均采用AU5800全自动生化分析仪(贝克曼公司)及配套试剂检测。

2 结果

2.1 一般资料 DPHCC组65例，其中男55例、女10例，年龄(55.00±16.50)岁；HCC组 80例，其中男67例、女13例，年龄(56.50±16.00)岁；肝硬化组120例，其中男98例、女22例，年龄(55.00±19.00)岁。

2.2 血清总N-糖链结果 DSA-FACE检测可将血清总N-糖链分为13个峰(paek1～peak12及peak9’)。各峰表示的N-糖链结构如图1所示，Peak1:NGA2F,无半乳糖-α-1,6-核心岩藻糖基化二天线结构；Peak2:NGA2FB,无半乳糖-α-1,6-核心岩藻糖基化平分型二天线结构；Peak3/Peak4:NG1A2F,单半乳糖-α-1,6-核心岩藻糖基化二天线结构；Peak5:NA2,双半乳糖二天线结构；Peak6:NA2F,双半乳糖-α-1,6-核心岩藻糖基化二天线结构；Peak7:NA2FB,双半乳糖-α-1,6-核心岩藻糖基化平分型二天线结构；Peak8:NA3,三半乳糖三天线结构；Peak9:NA3Fb,三半乳糖-α-1,3-分支岩藻糖基化三天线结构；Peak10:NA3Fc,三半乳糖-α-1,6-核心岩藻糖基化-α-1,3-分支岩藻糖基化三天线结构；Peak11:NA4,四半乳糖四天线结构；Peak12:NA4Fb,四半乳糖α-1,3-分支岩藻糖基化四天线结构。其中Peak1～Peak7为二天线N-糖链结构，Peak8、Peak9、Peak9’及Peak10为三天线N-糖链结构，peak11及peak12为四天线N-糖链结构， Peak8、Peak9、Peak9’、Peak10、Peak11及Peak12即为多天线N-糖链结构。

图1 N-糖链各峰糖型结构

2.3 三组中各指标的表达水平 DPHCC组、HCC组及LC组之间性别及年龄差异均无统计学意义(P值均>0.05)；肝功能指标中TP、Alb、ALT及AST差异均有统计学意义(P值均<0.05)，TBil差异无统计学意义(P>0.05)；血清肿瘤指标中AFP、PIVKA-Ⅱ、CEA及CA19-9差异均有统计学意义(P值均<0.05)；采用logictic回归方法构建常见指标模型(SUM，SUM=0.63×AFP+0.021×PIVKA-Ⅱ+0.01×CA19-9-0.006×CEA+0.037)，SUM在3组中差异也具有统计学意义(P<0.05)(表1)。13个N-糖链中，peak1、peak2、peak7、peak8及peak12差异均无统计学意义(P值均>0.05)，而peak3、peak4、peak5、peak6、peak9、peak9’、peak10、peak11及Multi-glycan差异均有统计学意义(P值均<0.05)，如表1所示。

2.4 三组中血清肿瘤指标及Multi-glycan的表达 DPHCC组与HCC组比较，仅Multi-glycan差异有统计学意义(P<0.05)，而AFP、PIVKA-Ⅱ、CEA、CA19-9及SUM差异均无统计学意义(P值均>0.05)；DPHCC组与LC组比较，Multi-glycan、AFP、PIVKA-Ⅱ、CA19-9及SUM差异均有统计学意义(P值均<0.001)，而CEA差异无统计学意义(P=0.14)(图2)。

图2 三组中血清肿瘤指标及Multi-glycan的表达

2.5 三组中血清肿瘤指标、差异N-糖链及Multi-glycan的AUC比较 DPHCC组与HCC组比较，各指标诊断DPHCC的AUC分别为：AUCMulti-glycan为0.775(95%CI:0.699～0.850)、AUCpeak3为0.596(95%CI:0.502～0.691)、AUCpeak4为0.566(95%CI:0.472～0.660)、AUCpeak5为0.559(95%CI:0.465～0.653)、AUCpeak6为0.656(95%CI:0.567～0.746)、AUCpeak9为0.583(95%CI:0.489～0.677)、AUCpeak9’为0.685(95%CI:0.599～0.772)、AUCpeak10为0.570(95%CI:0.457～0.683)、AUCpeak11为0.655(95%CI:0.566～0.744)、AUCAFP为0.507(95%CI:0.699～0.850)、AUCPIVKA-Ⅱ为0.584(95%CI:0.490～0.677)、AUCCEA为0.537(95%CI:0.442～0.632)、AUCCA19-9为0.505(95%CI:0.410～0.600)及AUCSUM为0.561(95%CI:0.467～0.655)。其中，AUCMulti-glycan显著高于AUCpeak3(Z=4.96,P<0.001) 、AUCpeak4(Z=4.81,P<0.001)、AUCpeak5(Z=4.73,P<0.001)、AUCpeak6(Z=2.97,P=0.003)、AUCpeak9(Z=3.79,P<0.001)、AUCpeak10(Z=3.19,P<0.001)、AUCpeak11(Z=3.10,P<0.001)、AUCAFP(Z=4.62,P<0.001)、AUCPIVKA-Ⅱ(Z=3.30,P=0.001)、AUCCEA(Z=3.99,P<0.001)、AUCCA19-9(Z=4.49,P<0.001)及AUCSUM(Z=3.60,P<0.001)，差异均有统计学意义(图3，表2)。

表1 三组中各指标的表达水平

DPHCC组与LC组比较，各指标诊断DPHCC的AUC分别为：AUCMulti-glycan为0.780(95%CI:0.713～0.848)、AUCpeak3为0.699(95%CI:0.625～0.772)、AUCpeak4为0.629(95%CI:0.552～0.706)、AUCpeak5为0.690(95%CI:0.616～0.763)、AUCpeak6为0.760(95%CI:0.704～0.806)、AUCpeak9为0.564(95%CI:0.479～0.649)、AUCpeak9’为0.606(95%CI:0.527～0.685)、AUCpeak10为0.631(95%CI:0.555～0.707)、AUCpeak11为0.508(95%CI:0.428～0.589)、AUCAFP为0.767(95%CI:0.691～0.844)、AUCPIVKA-Ⅱ为0.743(95%CI:0.645～0.841)、AUCCEA为0.537(95%CI:0.476～0.656)、AUCCA19-9为0.689(95%CI:0.625～0.779)及AUCSUM为0.713(95%CI:0.628～0.788)。其中，AUCMulti-glycan显著高于AUCpeak3(Z=5.65,P<0.001) 、AUCpeak4(Z=2.40,P=0.01)、AUCpeak5(Z=3.93,P<0.001)、AUCpeak6(Z=3.40,P<0.001)、AUCpeak9(Z=2.28,P=0.02)、AUCpeak9’(Z=5.31,P<0.001)、AUCpeak10(Z=2.59,P=0.009)、AUCpeak11(Z=4.14,P<0.001)及AUCCEA(Z=3.87,P<0.001)，差异均有统计学意义(图3，表2)。

2.6 三组中血清肿瘤指标及Multi-glycan的诊断效能分析 DPHCC组与HCC组比较，Multi-glycan的灵敏度与SUM相同均为69.23%，且比AFP、PIVKA-Ⅱ、CEA、CA19-9分别提高33.85%、41.54%、10.77%、35.38%；Multi-glycan的特异度与AFP相同均为73.75%，且比PIVKA-Ⅱ、CEA、CA19-9、SUM分别提高32.5%、51.25%、20%、17.5%。

DPHCC组与LC组比较中，Multi-glycan的灵敏度为89.23%，且比AFP、PIVKA-Ⅱ、CEA、CA19-9、SUM分别提高58.46%、24.61%、56.92%、76.92%、17.35%；Multi-glycan特异度为66.67%，且比CEA、CA19-9、SUM提高1.67%、20%、20.84%，而稍低于AFP、PIVKA-Ⅱ(表2)。

图3 三组中血清肿瘤指标、差异N-糖链及Multi-glycan的ROC曲线

表2 三组中各指标的诊断效能

3 讨论

DPHCC是近几年新发现的HCC新亚型，其总生存期和无复发生存期显著低于普通型HCC患者[1]。因此，DPHCC的早期诊断对于改善患者的诊疗现状、提高患者的预后生存具有重要意义。

N-糖链作为蛋白质翻译后糖基化修饰的产物之一，近年来已成为无创性肿瘤标志物的研究方向之一，可以作为胃癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌等肿瘤的血清学辅助诊断指标[11-13]。N-糖链主要通过蛋白Asn-XXX-Ser/Thr 序列(XXX为除脯氨酸以外的氨基酸)中Asn残基上的-NH2与蛋白相连[14-15]。多数糖蛋白的N-糖链为二或三天线(或分支)结构，少数为四天线结构，四天线以上较为罕见。其中三天线及以上天线结构的N-糖链称为Multi-glycan。

本研究结果显示，HCC组与DPHCC组中四天线N-糖链结构(peak11及peak12)及Multi-glycan的丰度均高于LC组，与Huang等[6]文献报道相似。同时，DPHCC组中Multi-glycan的丰度也显著高于HCC组(P<0.05)，提示Multi-glycan的丰度可能可用于DPHCC患者的血清学诊断。

DPHCC组与LC组ROC曲线分析结果显示，DPHCC组中Multi-glycan的AUC 不仅高于各单项差异N-糖链结构的AUC(peak3、peak4、peak5、peak6、peak9、peak9’、peak10、peak11)，也显著高于AFP、PIVKA-Ⅱ、CEA、CA19-9及SUM模型。Multi-glycan的灵敏度(89.23%)也均高于四项血清肿瘤指标及SUM模型。DPHCC组与HCC组ROC曲线分析结果显示，DPHCC组中Multi-glycan的AUC也显著高于各单项差异N-糖链结构、四项血清肿瘤指标及SUM模型，且Multi-glycan的灵敏度(69.23%)与SUM模型相同，均高于四项血清肿瘤指标。诊断效能分析结果进一步表明，Multi-glycan不仅能区分DPHCC与LC患者，也能很好的区分DPHCC与HCC患者。综上所述，Multi-glycan可以作为DPHCC的血清学辅助诊断指标。

伦理学审查：本研究于2020年2月14日经福建医科大学孟超肝胆医院伦理委员会批准，批号：科审2020_008_01。所有对象均签署知情同意书。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：冯惠娟、柳丽娟负责设计研究方案；张宇负责样本收集及分析；黄晨军、房萌负责样本检测与数据整理分析；卓传尚负责指导论文的撰写与修改。