改良Hulth法结合戊二醛注射建立大鼠膝骨关节炎模型

饶 奇，管俊航，陈 东

膝骨关节炎的主要特征是关节软骨的软化、变性、失去弹性并有进行性剥脱碎裂，滑膜摄取变性软骨碎片导致绒毛结节样增生，钙化软骨碎片形成游离体，并伴随关节韧带和半月板的退变，引起关节疼痛和功能障碍，严重影响行走功能和生活质量。随着社会的老龄化加剧，膝骨关节炎的发病率不断上升，需要深入研究新的治疗方法来减缓疾病进程[1]。但在未获得循证医学证实前，评估这些方法的有效性大多基于动物实验[2]。传统Hulth法造模通过手术方法完全切断膝关节的前交叉韧带、后交叉韧带及内侧副韧带，完整切除内侧半月板，操作难度高，容易损伤关节软骨面以及膝关节后血管和神经等组织。改良Hulth法相较于传统方法减少了后交叉韧带的切除，既可以使关节稳定性增加，又可以在降低操作难度的同时避免膝关节后方血管及神经损伤。但无论是传统造模还是改良造模方法，成功建立动物模型均需要6周以上的时间。研究[3-5]认为关节腔内注射化学试剂可以缩短造模时间。本研究采用改良Hulth法结合戊二醛注射建立大鼠膝骨关节炎模型，试图快速而有效地建立膝骨关节炎动物模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物无特定病原体(SPF级)SD大鼠32只，7～8周龄，体重200～250 g，雌雄不限，由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供。实验动物于SPF级动物房喂养，控制温度20～25 ℃，湿度 30%～60%，日夜周期12 h，自由饮食水，每周更换垫料。本研究于2020年8月～2020年11月在华中科技大学同济医学院动物实验中心完成。

1.2 器材与试剂BX53显微镜(Olympus)，一次性清创包，大鼠固定台，1%戊巴比妥钠(Merck公司)，Masson三色染色液(上海科汇生物技术有限公司)，4%戊二醛溶液(纯度99%，北京长江脉医药科技有限责任公司)，乙二胺四乙酸脱钙液(纯度99%，武汉卡诺斯科技有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1动物模型的制备 将32只大鼠采用随机数字表法分为模型组及对照组，每组16只。模型组采用改良Hulth法结合戊二醛注射的方法进行干预建立膝骨关节炎模型；对照组不做任何干预。模型组建模具体步骤如下：① 1%戊巴比妥钠1.0～1.5 ml(40 mg/kg)腹腔注射,待夹趾反射消失后，将大鼠俯卧位于固定台固定，用1%活力碘消毒右侧下肢2次，铺无菌巾。② 在右侧膝关节内侧剪开皮肤及筋膜，止血钳钝性分离膝部肌肉，找到内侧副韧带。在内侧副韧带与髌韧带之间用手术刀纵向划开暴露膝关节，切断副韧带，外展膝关节，找到内侧半月板，在内侧半月板前后分离内侧半月板，止血钳钳夹半月板中部提起，手术刀尖缓慢分离半月板直至完整夹出。③ 直视下切断前交叉韧带。④ 恢复膝关节正常位置，缝合肌肉，取4%戊二醛0.5μl注射于关节腔，逐步缝合关节囊、肌肉筋膜和皮肤，切口处1%活力碘消毒后放回笼饲养。见图1。

图1 模型组制备膝骨关节炎动物模型的步骤 A.找到并暴露右侧膝关节内侧副韧带(箭头所示)；B.切断内侧副韧带(箭头所示)；C.外展膝关节显露内侧半月板(箭头所示)；D.完整切除半月板；E.找到前交叉韧带并切断(箭头所示)；F.缝合关节囊及肌肉层后关节腔内注射4%戊二醛0.5 μl

1.3.2标本的取材及处理 两组处理方式相同。4周后将实验动物全部麻醉后处死。剪开大鼠右侧膝关节处皮肤，暴露右侧膝关节，离断膝关节远端与近端的胫骨和股骨，清理周围肌肉和结缔组织，只保留膝关节周围组织，将组织放置于预先配置的甲醛液中固定24 h后，10%乙二胺四乙酸脱钙液脱钙1周。常规脱水包埋并脱蜡至水，Weigert铁苏木素(Weigert铁苏木素A、B液等比例混合液)染9 min，流水稍洗；1%盐酸乙醇分化数秒，流水冲洗数分钟；丽春红酸性品红液染9 min，流水稍冲洗；磷钼酸水溶液处理约4 min，倾去玻片上磷钼酸溶液(不用水洗)。用Masson染色试剂盒内苯胺蓝液复染4 min，倾去玻片上染液(不用水洗)。1%冰醋酸水溶液冲洗切片，至切片无蓝色脱出；95%乙醇稍洗，无水乙醇水、二甲苯透明，中性树胶封固。染色结果：胶原纤维、黏液、软骨呈蓝色；肌纤维、纤维素和红细胞呈红色；细胞核呈蓝黑色。

1.4观察指标① 模型组术后连续观察3 d，记录体重、活动及饮食变化。② 光学显微镜下观察样本的滑膜和软骨的形态、数目、排列等情况。③ 对膝关节软骨组织进行改良Mankin评分，Mankin评分是评估结构(0～6分)、细胞异常(0～3分)、基质染色(0～4分)和潮汐完整性(0～1分)的综合评分，0分表示软骨正常，而14分表示最严重的软骨病变。由1名观察者对两组切片进行镜下Mankin评分，该观察者对切片分组不知情。

2 结果

2.1 模型组术后一般情况模型组大鼠术后均苏醒，术后3 d大鼠体重、食量、活动情况见表1，提示手术未导致大鼠出现死亡以及一般情况的明显变化。术后1周手术切口均愈合良好，未发现感染迹象，大鼠活动基本正常。

表1 模型组大鼠术后一般情况(n=16)

2.2 Masson染色组织学见图2。对照组：第4周，关节软骨表面光滑平整，厚薄一致，层次清晰；滑膜未见明显炎症细胞，未见毛细血管增生、充血，以脂肪组织为主。模型组：第4周，模型组关节软骨表面明显粗糙、凹凸不平整，关节软骨层厚薄不一致，部分软骨剥脱、碎裂，细胞明显增多；滑膜组织有中性粒细胞以及单核巨噬细胞浸润，毛细血管增多并充血，胶原纤维增多，部分增粗伴玻璃样变性。

图2 两组大鼠第4周膝关节软骨及滑膜Masson染色结果观察(×100) A. 对照组关节软骨表面光滑平整，厚薄一致，层次清晰(左图箭头所示)，滑膜未见明显炎症细胞，未见毛细血管增生、充血，以脂肪组织为主(右图箭头所示)；B. 模型组关节软骨发生了软骨细胞数目增多、软骨表面凹凸不平以及软骨层发生断裂的变化(左图箭头所示)，滑膜组织由原来大部分脂肪变成了少量脂肪、大量增生的毛细血管、中性粒及单核巨噬细胞浸润、胶原纤维增多(右图箭头所示)

2.3 改良Mankin评分第4周大鼠膝关节软骨组织改良Mankin评分：对照组为0～4(2.13±0.99)分，模型组为5～9(6.63±0.91)分，模型组明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

目前，晚期膝骨关节炎多采用膝关节置换术治疗，效果显著[6]；早中期膝骨关节炎则主要采用非手术治疗[7]。近年来，一些新兴的非手术治疗方法逐渐增多[8]，然而对这些新兴的疗法无法进行广泛、多中心的论证，只能通过动物实验来进行研究。所以建立早中期的骨关节炎动物模型对新兴疗法的评估是非常重要的。骨关节炎动物模型按动物类型可分为小型、大中型以及灵长类[9-10]。其中小型动物模型较为常用，这主要是因为小型动物不但具有容易获取、饲养方便、生存能力强、易于操作等优点，而且还可适用很多造模方法，包括制动、喂养、关节内注射化学物质、手术等[11-13]。

本研究采用改良Hulth法手术切除膝关节稳定装置结合戊二醛膝关节内注射，4周后成功建立了具有典型病理学特征的大鼠膝骨关节炎模型，Masson染色结果及Mankin评分显示，模型组膝关节呈早中期骨关节炎病理改变。汤晓晨 等[14]采用传统Hulth法将兔膝关节内侧副韧带、前后交叉韧带、部分内侧半月板切除造模，造模成功后组织病理切片结果显示，关节软骨层变薄，关节软骨裂隙缺损达中层，结构破坏较严重，软骨细胞数量明显减少，为晚期骨关节炎病理表现。本研究结果与之部分相似，不同之处是本研究显示软骨细胞数量增多，关节软骨病变程度较轻。对比结果，我们从临床分期治疗的角度来看，本研究模型更适合进行非手术治疗的干预。造成这种不同程度的病理改变的原因可能是改良Hulth法减少了后交叉韧带的切除，增加了膝关节的稳定性，进而减轻了关节不稳所致软骨细胞的坏死及凋亡。此外，还可能与关节腔内注射戊二醛导致胞膜氧化、膜蛋白变性引起细胞坏死凋亡后的反应性增生相关。王云峰 等(2009年)采用改良Hulth法对兔进行膝骨关节炎造模,造模6周后组织病理切片结果显示软骨组织学表现为中度软骨损伤，HE染色结果显示软骨表面裂隙可达放射层或钙化层，软骨细胞克隆增多，软骨细胞簇集，潮线完整，为中期骨关节炎病理表现。本研究结果与之基本相似，不同之处是本研究模型组较单一改良Hulth法缩短了2周造模时间。

已有研究[15-16]表明，通过手术造模方法所带来的手术创伤会使关节腔内炎症因子升高，特别是肿瘤坏死因子、白细胞介素-1、白细胞介素-6等。炎症因子的异常表达会导致软骨细胞凋亡增加，细胞外基质降解，最终导致骨关节炎的发生。关节腔内注射戊二醛可能影响了炎症因子浓度，也可能使炎症因子的活性降低，因此会对研究结果产生一定影响。此外，受实验条件的限制没有在实验前后进行血清炎症因子检测是本实验的不足之处，在今后的实验中需要进一步完善并验证。

综上所述，改良Hulth法结合戊二醛注射能快速而有效地建立大鼠早中期膝骨关节炎模型，造模成功时间较单一改良Hulth法提前了2周，动物死亡率低且造模成功率高，组织切片符合膝骨关节炎的病理表现。该造模方法是对原有动物模型研究的改进，操作方法规范可重复性强，经指导培训后即可掌握且易于推广；在保证模型质量的情况下，通过手术操作改进与化学试剂干预相结合的方法优化动物模型的建立，有利于实验研究和临床研究的成果转化。