负荷试验CT 灌注成像结合HIF1α、MMP2 及VEGF 评价大鼠C6 胶质瘤侵袭力

李竹君 陆 娜 于 洋 刘 颖△

（1复旦大学基础医学院病理学系 上海 200032；2复旦大学附属华山医院放射科 上海 200040）

胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是星形细胞胶质瘤中恶性程度最高的脑肿瘤。大部分患者的预后不佳，中位生存期一般低于1 年［1］。侵袭力在胶质瘤进展及其恶性程度评价中发挥着重要作用［2］，且已成为治疗神经胶质瘤的重要靶向［3-5］，因而评价胶质瘤的侵袭力在临床上有较高的应用价值。

评价胶质瘤侵袭力的金标准是免疫组织化学染色，主要有基质金属蛋白酶 2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）、缺 氧 诱 导 因 子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF1α）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等。MMP2 可以降解Ⅳ型胶原，即降解基膜可反映肿瘤侵袭力［6-7］；HIF1α 反映组织中的氧稳态，在胶质瘤的微血管生成中担任重要角色［8-9］；VEGF在肿瘤组织血管生成中发挥核心作用，指征胶质瘤侵袭力［10］。但免疫组化所用的组织标本一般通过手术、穿刺、活检等有创方式获取且周期较长，因此探寻一种无创活体评价胶质瘤侵袭力的方法有助于简化诊疗过程，减少患者负担。

乙酰唑胺是临床上常用来扩张血管的药物，在正常情况下会使脑阻力血管扩张进而引发脑血流量上升［11］。乙酰唑胺负荷常被用来检测脑血管异常区域，有用于诊断慢性脑供血不足、颈动脉狭窄等疾病的潜力［12-13］，但尚未应用到肿瘤诊断层面，而神经胶质瘤也无法耐受乙酰唑胺的舒血管作用。因此，通过乙酰唑胺负荷前后脑部CT 灌注生物标志物的变化可以了解胶质瘤的生长状况。本研究旨在寻找可以无创评价胶质瘤侵袭力的CT 灌注生物标志物。

材料和方法

大鼠胶质瘤模型建立20 只雄性清洁级SD（Sprgue-Dawley）大鼠（上海斯莱克实验动物有限公司），重约250~300 g，随机分成4 组，每组5 只，分别为胶质瘤原位植入10、14、18 天组以及对照组。接种前，每只大鼠用2%异氟烷麻醉，再将其固定于立体定位仪上，沿头皮中缝行纵线切口。在颅骨上钻1 mm 直径圆孔，孔洞位置在前囟前方1 mm，偏右3 mm。用微量进样针缓慢推入10 μL 的C6 胶质瘤PBS 混悬液，注射速度约为1 μL/min，深度在颅骨下方5 mm，留置5 min 后慢速抽出，用少量骨蜡轻擦孔洞，再缝合头皮。约10 天后大鼠C6 胶质瘤动物模型可建成。

SD 大鼠饲养均在清洁标准环境中，12 h/12 h光暗周期。实验操作符合复旦大学附属华山医院动物实验伦理要求（2020 华山医院JS-057）。

负荷试验与CT 灌注成像CT 扫描在256 层CT 机型（Philips Brilliance iCT 256，美国Cleveland公司）上开展，试验前大鼠先用2%异氟烷麻醉，将静脉留置针插入大鼠阴茎背静脉中以进行对比剂给药。首次扫描时确保整个鼠脑处于可扫描范围之内。用高压注射器以1mL/s 的流速注射对比剂欧 乃 派 克（2 mL/kg，Omnipaque®300，美 国GE 公司）。CT 灌注成像流程见本团队文献［14］。

CT 数据处理采用Philips 自带软件，流入动脉为大脑中动脉，基于去卷积运算，生成伪彩图。在每张彩图上划定3 个感兴趣区（region of interest，ROIs），取平均值。在乙酰唑胺负荷前后记录脑血流量（cerebral blood flow，CBF）、脑血容量（cerebral blood volume，CBV）、表 面通透性（surfacepermeability，PS），并计算百分比变化率。

免疫组织化学染色每组大鼠于对应天数进行CO2吸入型安乐死，然后用4%多聚甲醛进行灌注固定。所有大鼠脑组织石蜡切片均经标准化流程进行脱腊，抗原修复以及封闭后敷一抗。所用一抗为HIF1α（A16873，中国爱博泰克公司）、MMP2（NB200-193，美国Novus Biologicals 公司）和VEGF（9698，美国CST 公司）。使用DAKO En Vision 系统（peroxidase/DAB+，兔/鼠）在标准方案下检测抗体结合情况，苏木精衬染。

染好的组织切片由两名病理医师分析，一致性达100%。采用半定量方法，每张切片挑选3~5 个视野，在光学显微镜下拍照（Stemi 305，德国Carl Zeiss 公司），使用I-solution 软件（I-Solution，加拿大IMT 公司）计算阳性率。

统计学分析采用GraphPad Prism（version 8.0）统计学软件进行分析。独立样本配对t检验统计乙酰唑胺负荷前后影像学生物标志物之间的关系。ANOVA 检验不同肿瘤种植组间的差异。灌注生物标志物与HIF1α、MMP2、VEGF 之间的关系用Pearson 相关系数进行分析。经Bonferroni 校正后，P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

负荷试验前后组内灌注成像生物标志物对比与对照组相比，乙酰唑胺负荷前生物标志物CBF、CBV、PS 值均随种植天数的增加而上升（P<0.01）。施加负荷之后，CBF、CBV、PS 数值全部大于负荷之前的生物标志物值（P<0.01，表1）。14 天组别大鼠乙酰唑胺负荷前后CT 灌注彩图见图1。

表1 乙酰唑胺负荷前后CBF，CBV 和PS 水平Tab 1 Levels of CBF，CBV，PS pre-and post-acetazolamide challenge （±s）

表1 乙酰唑胺负荷前后CBF，CBV 和PS 水平Tab 1 Levels of CBF，CBV，PS pre-and post-acetazolamide challenge （±s）

（1）vs.pre-challenge，（2）vs.control，（3）vs.day 10，（4）vs.day 14 ，P<0.01.

Group Control Day10 Day14 Day18 n 555 5 CBFpre-challenge（mL·100 g-1·min-1）53.7±4.7 63.1±2.0（2）77.4±14.0（2）（3）95.0±1.4（2）（3）（4）CBF post-challenge（mL·100 g-1·min-1）118.4±18.3（1）163.5±3.0（1）154.7±6.9（1）146.9±2.5（1）CBV pre-challenge（mL/100 g）8.6±0.8 38.2±0.9（2）46.0±1.2（2）50.1±1.2（2）（3）CBV post-challenge（mL/100 g）19.3±1.5（1）57.3±1.3（1）57.3±7.7（1）62.3±2.3（1）PS pre-challenge（mL·100 g-1·min-1）1.2±0.1 10.9±0.8（2）15.5±0.6（2）（3）18.2±0.3（2）（3）（4）PS post-challenge（mL·100 g-1·min-1）11.2±0.8（1）31.0±0.8（1）27.0±0.2（1）19.0±0.2（1）

图1 大鼠C6 胶质瘤乙酰唑胺负荷前后CT 灌注彩图Fig 1 CT perfusion color maps in a rat with C6 gliomas pre and post acetazolamide challenge

负荷后不同组间灌注成像生物标志物对比与对照组相比，18 天组CBF 百分比变化率显著降低（P<0.01），10 天组、14 天组与对照组之间无明显差异。相对于对照组，10 天组、14 天组、18 天组CBV及PS 百分比变化率显著降低，且随着肿瘤种植天数的增加，CBV 及PS 百分比变化率随之降低（P<0.01，表2）。

表2 乙酰唑胺负荷前后CBF，CBV，PS 百分比变化率Tab 2 Percentage changes of CBF，CBV，PS pre-and post-acetazolamide challenge （±s）

表2 乙酰唑胺负荷前后CBF，CBV，PS 百分比变化率Tab 2 Percentage changes of CBF，CBV，PS pre-and post-acetazolamide challenge （±s）

（1）vs.Control，（2）vs.day 10，（3）vs.day 14，P<0.01.

Group Control Day 10 Day 14 Day 18 n 5 5 5 5 CBF percentage change（%）119.5±21.2 127.5±5.2 105.0±36.2 54.6±2.0（1）CBV percentage change（%）125.6±9.0 50.2±5.8（1）24.6±15.1（1）（2）24.5±4.3（1）（2）PS percentage change（%）816.2±116.4 185.5±19.8（1）74.6±6.0（1）（2）4.5±0.8（1）（2）（3）

免疫组织化学染色结果分析14 天组和18 天组 的VEGF、MMP2 和HIF1α 高 于10 天 组（P<0.01）。18 天 组 的VEGF、MMP2 和HIF1α 高 于14天组（P<0.01）。10 天、14 天和18 天组中所有免疫组化病理学标志物阳性率见表3。10 天、14 天和18天组的镜下免疫组化结果见图2。

图2 大鼠C6 胶质瘤HIF1α、MMP2、VEGF 免疫组织化学染色图Fig 2 Histologic images of HIF1α，MMP2 and VEGF staining in rats with C6 gliomas

表3 大鼠C6 胶质瘤HIF1α、MMP2 和VEGF免疫组织化学染色结果Tab 3 Histopathological values of HIF1α，MMP2，VEGF in rats with C6 gliomas （±s）

表3 大鼠C6 胶质瘤HIF1α、MMP2 和VEGF免疫组织化学染色结果Tab 3 Histopathological values of HIF1α，MMP2，VEGF in rats with C6 gliomas （±s）

（1）vs.day 10；（2）vs.day 14，P<0.01.

Group Day 10 Day 14 Day 18 n 5 5 5 HIF1α 2.82±0.9 5.7±0.7（1）9.2±1.1（1）（2）MMP2 1.8±0.5 3.9±0.8（1）7.2±1.1（1）（2）VEGF 3.9±0.3 7.5±1.7（1）12.4±1.3（1）（2）

灌注生物标志物与HIF1α，MMP2，VEGF 之间相关性分析HIF1α、MMP2、VEGF 与负荷前CBF、CBV、PS 呈正相关。HIF1α、MMP2、VEGF和CBF、CBV、PS 百分比变化率之间呈负相关（P<0.01，表4 和图3）。

图3 大鼠C6 胶质瘤HIF1α、MMP2、VEGF 与CT 灌注生物标志物之间Pearson 相关性分析图Fig 3 Pearson correlation diagrams between HIF1α，MMP2，VEGF and PCT with challenge parameters in rats with C6 glioma

表4 大鼠C6 胶质瘤HIF1α，MMP2，VEGF 与CT 灌注生物标志物之间Pearson 相关性分析Tab 4 Pearson correlation of PCT with challenge parameters and histopathological values in rats with C6 gliomas

讨 论

CT 灌注成像在脑肿瘤诊断中应用广泛，检查速度快、结果直观准确，可无创地评价微循环血流动力学变化。研究显示256 层CT 灌注成像生物标志物CBV、CBF 和PS 能有效反映人脑胶质瘤的血管生成状况，证明CT 灌注成像在评估肿瘤生长上有很大潜力［15］。评价肿瘤进展必须考虑多个因素，已有研究指出抗血管生成治疗会诱发肿瘤侵袭力增强进而导致其恶性进展［16］，因此，多维度评价胶质瘤进展至关重要。

HIF1α、MMP2 和VEGF 作为常 见的组织病理学生物标记物在胶质瘤评价中有重要意义。胶质瘤内部通常是缺氧环境，肿瘤细胞为了降低氧消耗会抑制HIF-1 降解，进一步活化HIF1α 亚基信号通路，刺激其下游因子如VEGF、MMP2 的表达，促进肿瘤血管生成，调节细胞代谢，增强肿瘤的生长与侵袭［17］。另一方面，研究指出VEGF/VEGF2 信号通路能增强血管通透性，帮助肿瘤细胞渗出和转移，VEGF 本身也可以降低肿瘤细胞免疫应答，促进肿瘤细胞的浸润，且VEGF 与MMP2 通常在肿瘤中 的 表 达 水 平 成 正 相 关［18-19］。由 此 可 见，HIF1α、MMP2 和VEGF 3 种因子的免疫组化染色结果能为评价大鼠C6 胶质瘤的侵袭能力提供有力证据。

本研究发现CBF 百分比变化率、CBV 百分比变化率和PS 百分比变化率与标记肿瘤侵袭力的组织病理学生物标志物间呈现负相关，即HIF1α、MMP2、VEGF 免疫组化阳性率越高，肿瘤的侵袭能力越强，病变血管对乙酰唑胺的反应也越微弱，表现在CBF、CBV 和PS 的百分比变化率越小。本研究注意到PS 百分比变化率相关性尤其显著，这一发现与先前研究结果吻合，即血脑屏障（blood brain barrier，BBB）完整性的破坏与胶质瘤的侵袭能力之间联系紧密，而血脑屏障完整性一般是用CT 灌注成像技术计算对比剂从血管内到血管外组织间隙的单向传输速率进而获得表面通透性（PS）的定量数据来表示［20-21］。

与磁共振（MRI）灌注成像相比，CT 灌注成像成本更低，检测方便，获得的是完全定量的数据，且CT 灌注成像不容易受钙化、出血、金属等影响，因此目前应用更加广泛［22］。本研究通过对比标准免疫组织化学诊断标记物，进一步明确CT 灌注生物标志物与肿瘤侵袭力的相关性，可能为临床医师提供更直观可靠的影像学依据。

本研究的局限性在于缺乏直接的临床试验证据，人与大鼠之间确实存在诸多差异。考虑到试验中辐射剂量随采集次数线性增加，确实不宜招募志愿患者在临床实践中进行该试验。但无论如何，本研究希望其结果可以为胶质母细胞瘤的临床影像学检测提供更多的解读思路。

综上所述，本研究证实CT 灌注成像影像学生物标志物CBF 百分比变化率、CBV 百分比变化率和PS 百分比变化率作为胶质瘤侵袭力预测指标有一定意义，乙酰唑胺负荷CT 灌注成像在无创评价胶质瘤侵袭力的过程中具有潜在的应用价值。

作者贡献声明李竹君 动物和细胞实验，文章撰写。陆娜 CT 影像学部分实验。于洋 影像学实验数据分析。刘颖 免疫组织化学结果分析。

利益冲突声明所有作者均声明不存在利益冲突。