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Omicron 株新型冠状病毒灭活疫苗(Vero 细胞)原液特异性鉴别试验RT-PCR 法的建立及验证

2022-06-23杨安纳庞德钦周以斯杨洁杨东升吴杰孟胜利王泽鋆郭靖申硕

中国生物制品学杂志 2022年6期
关键词:逆转录条带原液

杨安纳,庞德钦,周以斯,杨洁,杨东升,吴杰,孟胜利,王泽鋆,郭靖,申硕

武汉生物制品研究所有限责任公司,湖北 武汉 430060

2019年12月以来,由新型冠状病毒引起的新型冠状病毒肺炎迅速在全球蔓延,随后出现多种突变株。从2021年11月9日在南非采集,并于2021年11月24日向WHO 报告的样本中,首次确认了B.1.1.529 突变株[1-2]。WHO 于 2021年11月26日将该突变株列为第5 种“密切关注突变体”(variant of concern,VOC),以希腊字母命名法命名为Omicron(奥密克戎)[3]。截至2022年3月中旬,在全球范围内每日新增的140 多万患者中,超过99%的感染均由Omicron 突变株引起,该毒株已成为全球超过150个国家或地区的绝对优势流行毒株;较以前的突变株更容易感染年轻人和中年人[4],且具有更强的传播能力[5],在肺部的复制性低于Delta 突变株和原型株[6-7]。目前有研究表明,多种技术路线研制疫苗的免疫血清及多种突变株康复者血清,对Omicron 株新型冠状病毒的中和作用均明显下降[8-13]。

由于该突变株免疫逃逸严重,多款疫苗针对其保护效力下降[14-18]。因此研发针对该毒株的改良型疫苗是遏制其传播的手段之一。

相比于原型株的刺突蛋白基因序列,Omicron株新型冠状病毒的刺突蛋白至少存在30 个氨基酸改变,与以往的新型冠状病毒变异株相比,该突变株具有更高的突变程度[19-20]。其中在69、70 位缺失6 个碱基 5′-ACATGT-3′,214 位增加 9 个碱基 5′-GCCAGAAGA-3′。因此针对这2 处位点设计2 对引物,可通过RT-PCR 区分Omicron 株与其他新型冠状病毒。

本研究将RT-PCR 法应用于Omicron 株新型冠状病毒灭活疫苗(Vero 细胞)原液的特异性鉴别试验,并对其进行了验证。

1 材料与方法

1.1 疫苗原液 原型株新型冠状病毒灭活疫苗(Vero 细胞)原液(批号:S202103Y001,简称原型株原液)、Omicron 株新型冠状病毒灭活疫苗(Vero 细胞)原液(批号:202201Y001、202201Y002、202201-Y003、202201Y004、202202Y005、202202Y006,简 称Omicron 株原液)、Beta 株新型冠状病毒灭活疫苗(Vero 细胞)原液(批号:202112Y001B,简称 Beta 株原液)、Delta 株新型冠状病毒灭活疫苗原液(Vero 细胞)(批号:202108Y001,简称 Delta 株原液)均由武汉生物制品研究所有限责任公司提供。

1.2 主要试剂及仪器 RNA 抽提试剂盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit)购自德国 QIAGEN 公司;逆转录试剂盒(PrimeScriptⅣ1st strand cDNA Synthesis Mix)购自日本 TaKaRa 公司;Q5 High-Fidelity 2 ×Master Mix 购自美国 NEB 公司;DNA marker 购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司;RNase free dH2O、Agarose G-10 购自上海碧云天生物技术有限公司;PCR 仪购自美国Applied Biosysteme 公司;凝胶成像系统购自英国Syngene 公司。

1.3 引物设计及合成 根据GIAIDS 数据库中新型冠状病毒Omicron 株基因组序列(EPI_ISL_402124),应用 Snapgene 软件设计 6 条引物,OSTF1:5′-CTTGGTTCCATGTTATCTCTGG-3′;OS1R:5′-CCCTGAGGGAGATCTTCTGGC-3′;OSTF3:5′-ATAGTGCGTGAGCCAGAAGA-3′;S2R:5′-CCTGAAGAAGAATCACCAGGAGTC-3′;S1F:5′-CCACGCGAACAAATAGATGGTTATGTCATG-3′;OSTR1:5′-CCATTGGTCCCAGAGATAA-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 样本RNA 提取及逆转录 使用QIAamp Viral RNA Mini Kit 试剂盒提取供试品RNA。于1.5 mL离心管中加入 560 μL AVL 溶液,5.6 μL carrier RNA,140 μL 供试品,振荡 15 s 混匀,室温静置 10 min;瞬时离心,加入 560 μL 无水乙醇,振荡 15 s 混匀;瞬时离心,取上述溶液630 μL 加至吸附柱中(吸附柱放至收集管中),7 227 × g 离心 1 min;将吸附柱放至新的收集管中,吸取剩余溶液,加至试剂盒的吸附柱中(吸附柱放至收集管中),7 227 × g 离心 1 min;将吸附柱放至新的收集管中,加入500 μL AW1 溶液,7 227 × g 离心1 min;将吸附柱放至新的收集管中,加入 500 μL AW2 溶液,16 260 × g 离心 3 min;将吸附柱放至新的收集管中,16 260 × g 离心1 min;将吸附柱放至1.5 mL 离心管中,加入60 μL AVE溶液,室温静置 1 min;7 227 × g 离心 1 min;弃吸附柱,管中滤过液即为供试品RNA。用PrimeScriptⅣ1st strand cDNA Synthesis Mix 试剂盒将供试品RNA逆转录为 cDNA,冰上配制 20 μL 反应体系:4 μL 5 ×PrimeScriptⅣstrand cDNA Synthesis Mix,2 μL Random 6 mers(50 μmol/L),8 μL RNA,6 μL RNase Free dH2O,混匀。PCR 仪按以下条件反应:30 ℃ 10 min;42 ℃ 20 min;70 ℃ 15 min 使酶失活后,冰上冷却,即得cDNA。

1.5 PCR 扩增及产物鉴定 以合成的cDNA 为模板,利用正、反向引物进行PCR 扩增。配制50 μL反应体系:Q5®High-Fidelity 2 × Master Mix 25 μL,正反向引物各 2 μL,模板 cDNA 1 μL,RNase Free dH2O 20 μL。PCR 反应条件:94 ℃预变性 2 min;94 ℃变性 30 s,63 ℃复性 30 s,72 ℃延伸 30 s,共35 个循环;72 ℃延伸5 min。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,凝胶成像系统进行条带分析。

1.6 引物筛选 根据Omicron 株S 基因序列中相比于其他突变株所特有的插入及缺失基因序列设计4对引物:OSTF1 / OS1R、OSTF3 / S2R、S1F / OSTR1和OSTF1 / S2R,分别利用这4 对引物对原型株及Omicron 株原液进行RT-PCR 检测,观察条带特异性,筛选合适引物。

1.7 方法验证

1.7.1 专属性 取202201Y001 批Omicron 株原液、S202103Y001 批原型株原液、202112Y001B 批 Beta株原液、202108Y001 批 Delta 株原液,按照 1.4 项方法进行RNA 提取及逆转录,按照1.5 项方法进行PCR 及1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7.2 重复性 取 202201Y0011 批 Omicron 株原液,按照1.4 项方法重复进行3 次RNA 提取及逆转录,按照1.5 项方法进行PCR 扩增及1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7.3 中间精密度 取202201Y001 批Omicron 株原液,由2 名实验人员按照1.4 项方法重复进行3 次RNA 提取及逆转录,按照1.5 项方法进行PCR 扩增及1%琼脂糖凝胶电泳检测。重复检测3 d。

1.7.4 耐用性 取202201Y001 批Omicron 株原液,按照1.4 项方法重复进行3 次RNA 提取及逆转录,以 cDNA 为模板,设置不同(53、55、58 ℃)PCR 反应退火温度,其他条件不变,按照1.5 项方法进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7.5 灵敏度 用PBS 对202201Y001 批Omicron株原液进行稀释,使其蛋白浓度分别为25、5、1、0.2、0.04、0.008 μg / mL,按照 1.4 项方法进行 RNA 提取及逆转录,按照1.5 项方法进行PCR 扩增及1%琼脂糖凝胶电泳检测。用PBS 对提取的病毒RNA进行梯度稀释,使其核酸浓度分别为80、16、3.2、0.64、0.128、0.025 6 ng / μL,按照 1.4 项方法进行逆转录,按照1.5 项方法进行PCR 扩增及1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.8 方法的初步应用 取6 批Omicron 株原液,按照1.4 项方法进行RNA 提取及逆转录,按照1.5 项方法进行PCR 扩增及1%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结 果

2.1 方法的建立 使用引物 S1F / OSTR1、OSTF1 /S2R 进行RT-PCR 检测,原型株和Omicron 株均能扩增出相同大小的条带,不具备区分两者的能力;使用引物 OSTF1 / OS1R、OSTF3 / S2R 进行 RT-PCR 检测,仅Omicron 株扩增出条带,具备区分原型株与Omicron 株的能力,且引物 OSTF1 /OS1R 中 2 条引物均包含了Omicron 株的特征突变位点序列:OSTF1包含了 69、70 位缺失的 6 个碱基 5′-ACATGT-3′,OS1R包含了214 位插入突变的9 个碱基5′-GCCAGAAGA-3′,特异性更强。因此选择引物 OSTF1 / OS1R作为该方法的引物。见图1。

图1 RT-PCR 法引物筛选的凝胶电泳图Fig.1 Electrophoretic profile for screening of primers for RT-PCR

2.2 方法的验证

2.2.1 专属性 Omicron 株原液经RT-PCR 检测可扩增出约 460 bp 的条带,而原型株、Beta 株、Delta 株原液均无扩增条带,见图2。表明该方法专属性良好,能有效区分Omicron 株与其他突变株。

图2 RT-PCR 法专属性验证凝胶电泳图Fig.2 Electrophoretic profile for validation of specificity of RT-PCR

2.2.2 重复性 3 次试验Omicron 株原液经RT-PCR检测均能扩增出约460 bp 的条带,见图3。表明该方法重复性良好。

图3 RT-PCR 法重复性验证凝胶电泳图Fig.3 Electrophoretic profile for validation for reproducibility of RT-PCR

2.2.3 中间精密度 2 名实验人员重复3 次对Omicron 株原液进行RT-PCR 检测,共检测3 d,均能扩增出约460 bp 的条带,见图4。表明该方法中间精密度良好。

图4 RT-PCR 法中间精密度验证凝胶电泳图Fig.4 Electrophoretic profile for validation for intermediate precision of RT-PCR

2.2.4 耐用性 Omicron 株原液在 53、55、58 ℃退火温度下,经RT-PCR 检测均能扩增出约460 bp 的条带,见图5。表明在53 ~ 58 ℃范围内改变退火温度,该方法均能得到较好的实验结果。

图5 RT-PCR 法耐用性验证凝胶电泳图Fig.5 Electrophoretic profile for validation for durability of RT-PCR

2.2.5 灵敏度 随着Omicron 株原液蛋白和RNA浓度的降低,电泳条带亮度逐渐降低,蛋白浓度在0.04 μg /mL 以上、RNA 浓度在 0.128 ng / μL 以上,均能扩增出较亮的约460 bp 的条带,见图6。表明该方法具有较高的灵敏度。

图6 RT-PCR 法灵敏度验证凝胶电泳图Fig.6 Electrophoretic profile for validation for sensitivity(RNA concentration)of RT-PCR

2.3 方法的初步应用 6 批Omicron 株原液经RT-PCR检测,均可见约460 bp 的条带,见图7。

图7 Omicron 株原液RT-PCR 产物凝胶电泳图Fig.7 Electrophoretic profile of RT-PCR products of bulk of inactivated vaccine against Omicron strain

3 讨 论

灭活疫苗成品多通过抗体与抗原特异性结合的反应原理建立的方法来进行抗原鉴别试验,如伤寒疫苗通过与相应的血清进行玻片凝集试验,根据是否有明显凝集反应进行鉴别;A 群C 群脑膜炎球菌多糖疫苗采用免疫双向扩散法,根据是否能与相应抗体形成明显沉淀线进行鉴别;吸附破伤风疫苗通过凝胶免疫沉淀试验,根据是否出现免疫沉淀反应进行鉴别试验[21]。目前《中国药典》三部(2020 版)已有一些基于核酸序列特征建立的鉴别方法,如皮内注射用卡介苗成品鉴别,采用多重PCR 法检测卡介菌基因特异性的缺失区RD1[22]。双价肾综合征出血热灭活疫苗成品鉴别,采用RT-PCR 法扩增Ⅰ型和Ⅱ型出血热病毒特异性条带[21-22]。

本研究根据Omicron 株S 蛋白基因序列特有的插入、缺失序列设计了仅针对该突变株具有扩增作用的引物,利用该引物建立了RT-PCR 检测方法,该方法可区分Omicron 株与原型株、Beta 株及Delta株。验证结果表明,该方法专属性、重复性、日间精密度、耐用性和灵敏度良好,可用于Omicron 株新型冠状病毒灭活疫苗原液鉴别。但由于未筛选到适宜的解吸附剂,因此目前还仅能应用于疫苗原液阶段的鉴别。后续会继续筛选合适的解吸附剂,以便将该方法用至成品阶段的鉴别试验。

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