全转录组测序在临床医学上的应用

2022-11-16刘卓航综述董少忠审校

中国生物制品学杂志 2022年6期

刘卓航综述，董少忠审校

1.中国医学科学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，云南昆明 650118；2.昆明医科大学，云南昆明 650500

自1995年科学家首次在酵母细胞中获得第1个转录组，并提出转录组这个概念［1］，到现在的后基因组学时代，转录组作为连接基因组和蛋白质组遗传信息与生物功能的必然纽带，在生物领域获得了持续广泛的关注［2］。全转录组有2 种不同的定义：一种指全部mRNA 的集合，另一种指某个物种或特定细胞在某一功能状态下产生的所有RNA 的总和，包括各类编码RNA 和各类非编码RNA（non-coding RNA）［3］。不仅是在生物学方面，在其他领域尤其是临床医学方面，全转录组测序技术也具有重要作用。本文对全转录组测序在探索一些复杂疾病的发病机制和诊断标志物方面应用的最新进展作一综述。

1 全转录组测序平台

全转录组学研究与测序平台的变革密切相关。近年来，测序平台的每一次变革均对全转录组学的研究模式产生了深刻的影响，发挥了巨大的推动作用［4］。

1.1 第一代测序技术平台 20 世纪70年代末，SANGER 等［5］发明了双脱氧终止法，实现了对 DNA序列的测序与分析，以此为标志的第一代测序技术的出现，极大地促进了转录组学研究。但由于Sanger测序本身存在的基因定量偏差，通量较低和自动化相对较差等问题，逐渐被淘汰。

1.2 第二代测序技术（next generation sequencing，NGS）平台随着研究者对测序技术的不断改良和革新，NGS 出现。与第一代测序技术相比，NGS 具有精确度和灵敏度更高，覆盖度更均匀，转录信息更丰富，数据质量更高，成本更低等优势，成为近年来转录组方面研究的主要方法。目前，全转录组测序的平台有很多，其中主要有罗氏公司的454、美国应用生物系统公司公司的SOLiD 和米鲁纳公司的Solexa三大平台［6］。在过去10年间，Illumina 公司的Solexa技术，即边合成边测序（seq-uencing by synthesis，SBS）技术发展迅速，其中HiSeq 系列的测序平台成为NGS中应用最广泛的平台［7］。

1.3 第三代测序技术平台最近几年逐渐兴起的第三代测序技术（next-next generation sequencing）又称为单分子实时测序技术，以Pacific Biosciences（Pac-Bio）公司的单分子实时测序（single molecule real time sequencing，SMRT）［8］和 Oxford Nanopore Technologies 公司的纳米孔单分子测序技术为代表［9］。其具有比NGS 更大的通量和更高的效率，且不需经过桥式扩增。

2 全转录组测序的原理和基本步骤

全转录组测序是指运用高通量测序技术将生物体在某一特定状态下的编码和非编码RNA 的序列测定出来，以获得研究样本几乎所有的转录组［3］。

首先对目标样品的总RNA 进行提取，再根据需求进行样品处理，根据所选用的全转录组测序平台的要求将所需的RNA 片段化，构建测序文件，进行桥式PCR 扩增，达到一定的丰度上机测序，以获得需要的序列，再将所得到的序列与参考基因比对，形成全基因组范围内的转录谱，进行生物信息分析［10］。

3 全转录组测序在临床上的应用

全转录组技术的发展带来的变革不仅仅是在生物学方面，还体现在在临床医学的各个领域。

3.1 全转录组测序技术在疾病诊断标志物研究中的应用全转录组测序技术在针对一些复杂疾病的诊断标志物的检测方面提供了更加丰富可靠的检测手段。有研究者运用RNA-seq 技术对扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy，DCM）和限制性心肌病（restrictive cardiomyopathy，RCM）患者进行全转录组测序分析，揭示了心衰患者蛋白编码和lncRNA 的一种特殊表达模式，证实了患者的左室心肌生物标记物可通过基于转录组测序技术的方法可靠地识别，提供了对心力衰竭患者的心衰标志物更可靠的检出手段［11］。尤其是面对一些现有医学手段难以解决的疾病，如精神分裂症（schizophrenia，SCZ）。这类重度精神类疾病缺乏特异的诊断标志物，在临床上一般只能以患者症状作为诊断标准，常规检测手段的缺陷常导致诊断困难。而全转录组测序技术的运用很好地改善了该问题，如有研究者使用全转录组测序技术对SCZ 患者外周血单个核细胞的circRNAs表达谱进行测序，差异表达分析，发现并验证了新的SCZ 分子诊断标志物，为诊断SCZ 提供了更加可靠的临床依据［12］。

全转录组测序同样也为一些复杂疾病的诊断提供了新的潜在诊断标志物。如库欣病，有研究通过全转录组测序技术对垂体ACTH 腺瘤全转录组测序，在转录组水平筛选相关差异表达基因和microRNA，并与患者临床表型进行关联分析，为筛选库欣病诊断标志物提供了可能的依据［13］。有研究表明，运用RNA-seq 技术对3 对结直肠癌（colorectal cancer，CRC）和匹配的正常黏膜（normal mucosa，NM）进行了全转录组分析，分析差异基因表达，发现了可能用于鉴定直肠癌的新的生物标志物［14］。

3.2 全转录组测序技术在疾病分子机制研究中的应用全转录组测序同样为复杂疾病的分子机制研究提供了新的技术和方向，也为临床上更好地防控和治疗这些疾病提供了新的思路和策略。

有研究显示，全转录组测序能够用于分析2 型糖尿病和冠心病患者的心外膜组织脂肪（epicardial adipose tissue，EAT），通过鉴定分析差异表达基因，发现高血糖引起的氧化应激反应可能与患者EAT变化有关，为糖尿病患者中引起动脉粥样硬化的新途径提供了依据［15］。

全转录组测序技术同样也在疾病的临床治疗策略上提供了新的思路。如狂犬病，有研究者提取了狂犬病病毒CVS11 感染小鼠的脑细胞，并进行全转录组分析，检测到大量差异基因表达和lncRNA变化，为狂犬病病毒感染机体免疫反应和免疫应答的探索提供了参考，也为开发新的狂犬病有效治疗药物或疫苗提供了新的策略与方向［16］。有研究者使用全转录组测序技术比较了人类CD4+T 细胞与Nef-deleted（Δ-Nef）NL4-3 病毒，分析差异基因表达，表明在HIV-1 中Nef 蛋白的作用下，干扰素反应、IL-15 和JAK ／ STAT 信号通路以及参与细胞代谢、凋亡、细胞周期调控和核糖体生物发生的基因均发生改变，这些改变可能在启动宿主细胞进行细胞活化和病毒复制方面发挥作用［17］。另外，将全转录组测序技术运用于各类动物模型和人类的肌肉组织，发现了骨组织中新的细胞类型，以及可能导致骨髓炎和骨质疏松等骨骼疾病的新基因和新转录因子［18］。

在如何有效防控和治疗恶性肿瘤这类问题时，全转录组测序也提供了新的方向和解决策略。运用全转录组测序可检测出一些传统手段难以检测出的肿瘤驱动因素，如拼接变异和基因组变化等。有研究者运用全转录组测序技术检测多例多形性腺瘤（pleomorphic adenoma，PA）患者的配对肿瘤与瘤旁唾液腺腺体，筛选两组间差异基因，分析预测差异基因所编码蛋白间的相互作用，挖掘这些差异基因在肿瘤形成过程中的作用及通路［19］。还有研究者对患者的癌组织和正常组织进行全转录组测序分析，发现142 个差异表达基因，这些差异表达基因与肿瘤的增殖、迁移、黏附、血管生成及凋亡等生物学行为密切相关［20］。另外，还可通过全转录组测序技术识别导致肿瘤形成及对治疗产生抵抗的相关靶基因，对进一步指导其临床治疗和诊断具有重要的理论及实践意义［21］。在一些研究中，研究者运用全转录测序技术分析与结肠癌相关的lncRNA，分析其中差异基因的表达，并阐明这些相关基因可能与肿瘤生成有关［22］。另外，全转录组测序技术还能筛选潜在的抗原表位和治疗靶点。有研究者联合全转录组测序（RNA-seq）和质谱分析（mass spectrometric，MS）两种技术分析基因和蛋白的差异表达情况，通过HLA I 等位基因检测结合RNA-seq 的基因变异、融合基因结果预测，并筛选潜在的肿瘤新抗原或抗原表位，为了解甲状腺癌的生物学行为和免疫因素在甲状腺癌诊治中的作用奠定了实验基础［23］。

随着全转录组测序技术在研究疾病分子机制领域的逐渐深入，其必然成为防控和治疗多种复杂疾病的新技术。

3.3 全转录组测序在微生物检测方面的应用在临床检验学领域，全转录组测序技术的发展同样带来了变革。传统的病原微生物鉴定技术主要分为2类：基于细胞培养的方法（如形态学观察、细胞生理生化特征、细菌培养分型、基因芯片、自动化微生物分析系统等）和基于特异引物／探针／抗体的方法（如抗原抗体反应）［24］。但这些传统的微生物检测方法均存在不足，尤其是在面对未知和突变病原体时。而通过运用全转录组测序技术，构建基于高通量测序技术的病原体检测系统，则为病原微生物的检测提供了新的更加方便、快速的手段，尤其是对于常规手段不易检出的病原物。如2019年底暴发的新发肺炎疫情，经鉴定病原体为一种新型冠状病毒［25］。此次疫情的暴发给传统的病原体检测带来巨大挑战，如何快速地从患者体内鉴定出冠状病毒显得非常重要。有研究者利用全转录组测序技术快速检测高通量测序数据中的冠状病毒核酸序列，能够灵敏、快速地从高通量测序数据中检测出冠状病毒序列，具有很好的泛化能力，可对新发和高变异株冠状病毒序列进行准确的检测［26］。