mRNA 疫苗的研究进展

袁军鸿 ，杨昭庆 综述，马绍辉 审校

1.昆明医科大学，云南 昆明 650500；2.中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所，云南 昆明 650031

mRNA 是DNA 翻译成蛋白质的中间产物，mRNA疫苗是指用各类病原微生物的mRNA 制作的用于预防或治疗的生物制品［1］。目前作为疫苗主要研究的有两种类型的RNA：非复制型mRNA 和病毒衍生的自扩增mRNA。非复制型mRNA 是指已经在体外合成的一段完整的基因序列，其通过载体递送进体内后能够诱导一定的免疫反应。病毒衍生的自扩增mRNA 通常选用甲病毒属的基因组，保留其复制机制所需的基因结构而将其原本的结构蛋白区替换为目的基因序列，这类mRNA 疫苗在体内能自主复制，仅需极少量便能诱导较强的免疫反应。在早期的研究中，mRNA 受到许多疫苗研究者的关注，因为其表现出优于亚单位和减毒活载体疫苗的特点，即可较好地诱导体液和细胞免疫应答［2］。同时，由于mRNA 存在于细胞质中，不会发生随机整合至基因组的风险，因此从疫苗应用的角度来看具有较高的安全性。但由于mRNA 通常不稳定且易被酶降解，导致其在疫苗研发及应用中的局限性，因此需要对mRNA 的结构进行一定的优化以增强其稳定性，如ZHAO 等［3］使用了 2 个 β 珠蛋白（β-globin）非结构区（UTR），明显增强了 mRNA 的稳定性。mRNA 疫苗在肿瘤治疗方面也取得了一些初步进展，如利用肿瘤患者的肿瘤RNA，在白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony stimulating factor，GM-CSF）的联合作用下诱导树突状细胞（dendritic cells，DC）的产生，并且使用自身肿瘤的mRNA 冲击DC，使其产生特异性免疫反应［4］。因为mRNA 的不稳定性及转染效率低等原因，在既往的应用研究中，科学家们并不认为其是理想的、可进行临床推广使用的疫苗。近年来，随着生物技术的发展，通过结构改造和递送载体平台优化等，在很大程度上解决了mRNA 作为候选疫苗存在的稳定性差和转染效率低等问题，逐步展现了mRNA 作为疫苗的一些独特优点。本文对mRNA 疫苗的结构设计和优化及传递系统和疾病防治应用方面取得的进展作一综述。

1 mRNA 疫苗的结构设计及优化

mRNA 通常是在体外经cDNA 或质粒DNA 转录获得，在体外合成时，需人为添加加帽酶（capping enzyme，CE）和 Poly A 聚合酶。mRNA 由 5′帽结构、5′UTR、开放阅读框（编码靶蛋白）、3′UTR 以及 3′PolyA尾巴构成。在mRNA 进入体内发挥作用时，由于mRNA 的一些不稳定结构，如5′帽端以及一些UTR 会导致mRNA 被细胞内外存在的核酸酶降解，因此要对其不稳定的部分进行一些改造。

KALIEN 等研究者与Stitz 的团队合作设计出使用活性设计技术的mRNA 疫苗，包括优化mRNA 碱基对含量、编码UTR 和络合鱼精蛋白（一种富含精氨酸的蛋白质，能结合和稳定mRNA）［5］。mRNA UTR内的调节元件能够增强mRNA 的稳定性，Poly A 也能够增加mRNA 的稳定性和靶蛋白的表达［6］。因此，一些研究者尝试通过改变一些非编码蛋白的UTR，并通过结合其他复合物（如脂质体）来增加mRNA的稳定性［7］。除了添加Poly A 等结构外，新近也有研究者设计出缺乏5′帽端和3′poly 尾端的mRNA，并使其包含丙型肝炎病毒（HCV）的核心基因后，用于转染DC 细胞，结果表明，mRNA 在DC 细胞中表达抗原方面是有效的［8］。考虑到制备这种体外转录信使 RNA（in vitro transcription of messenger RNA，IVT mRNA）具有简单而有效的方案及其在表达所携带基因方面的有效性，IVT mRNA 可能适用于开发针对HCV 的RNA 疫苗。

此外，通过合成1 个高级的cap 结构，并将UTR和1 个扩展的poly（A）尾巴整合至序列中，可实现对mRNA 分子中多个结构元素的优化，这些修饰均可提高编码蛋白的表达水平［9］。一项关于结核分枝杆菌Ag85B-mRNA 疫苗的体外合成的研究结果显示，mRNA 疫苗在经过优化Ag85B 编码区序列及在其两端插入 β 球蛋白 3′和 5′UTR 序列后，获得了较高的免疫原性和稳定性［10］。最近一项新的报道讲述了一种新颖且普遍适用的基于细胞的选择过程，可用于鉴定特定序列的3′UTR，这些新的UTR 可显著增加IVT mRNA 的蛋白表达［11］。研究发现，新型3′UTR 基序相对于β 球蛋白3′UTR 序列能够诱导更强的治疗效果［12］。此外，当前某些mRNA 纯化方法，如HPLC 法，其在小规模制备下效果较好，但在大规模生产方面却具有一定局限性，如效率低、投资成本较高等。BAIERSDORFER 等［13］报道了一种通过将纯化过程中可能会产生的双链RNA 杂质吸附至纤维素（一种廉价而丰富的多糖）上来纯化mRNA的方法，由于其成本较低、所需时间较短等，可被用于实验室和大规模生产等。

2 mRNA 疫苗的递送系统

2.1 以脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle，LNP）为载体平台 尽管体外转录mRNA 疫苗的设计在高效、低成本、低先天免疫原性方面取得了重大进展，但将mRNA 广泛用于治疗，还同时需要具有安全有效的体内递送系统。非病毒载体是目前体外转录mRNA治疗递送系统中的前沿研究领域，而LNP 是其中被认为最有发展和应用前景的mRNA 类载体［14］。GUTMARAES 等［15］设计了 1 个快速筛选体内mRNA传递的平台，其包括1 个封装了功能性条形码mRNA（b-mRNA）的LNP 文库。这些b-mRNA 在结构和功能上与普通mRNA 相似，并含有条形码，可通过深度测序对体内mRNA 的表达进行定量。结果表明，该平台可识别LNP 的候选物以及确定体内mRNA递送的最佳参数（如载体的大小与结构等），可加速LNP 在体内的筛选及设计，使相应的mRNA 疫苗在体内能够发挥更好的疗效。

有报道使用凝胶电泳来研究阳离子纳米脂蛋白颗粒（nanolipoprotein particles，NLPs）与 mRNA 间的结合能力，由于NLPs 与RNA 分子的配位作用及RNA 复合物尺寸的变大导致阻碍了阴离子型RNA 分子向阴极的迁移，从而证明了阳离子NLPs 与mRNA间具有一定的结合能力［16］。mRNA 可通过脂质体或其他复合体等载体系统进入细胞内，进一步增强mRNA 在体内的转染效率［17］。WONG 等［18］制备了一种NLPs，该颗粒封装了来自寨卡病毒的M 蛋白和E 基因的mRNA 疫苗，将其注入小鼠体内后能诱导免疫保护和杀菌作用，表明该颗粒作为一种载体能够成功运输mRNA，使其在体内发挥免疫作用。最近有研究人员利用LNP 包裹1-甲基假尿核苷修饰的mRNA 疫苗，以皮内接种方式向小鼠模型传递保守的流感病毒抗原，并诱导出具有相当广度和效力的强免疫应答［19］，表明被核苷修饰的mRNA 能够成功诱导较强的免疫反应，并且可考虑使用其他接种方式探讨其是否能够诱导更强的免疫反应。

2.2 以聚合物为载体平台 除了以脂质体复合物作为载体外，PEG12KL4 是一种新的RNA 传递载体，其中合成的阳离子KL4 肽附着在12-mers 的单分散线性PEG 上。有研究将PEG12KL4 以10 ∶1 的比例（w ／ w）与mRNA 形成纳米复合物，介导了对人肺上皮细胞的有效转染［20］。也有研究将环糊精（cyclodentrin，CD）与聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，PEI）600 或 PEI2k 共同混合得到不同 CD ／ PEI 比例的CP（CD-PEI）聚合物，并评价了 CP600、CP2k 和 PEI25k作为鼻内mRNA 疫苗载体的传递效果。结果显示，在这些聚合物中，CP2k ／ mRNA 在体外转染效率明显高于PEI25k ／ mRNA，具有更强的向淋巴结迁移和刺激DC 细胞在体内成熟的能力，进而导致更强的体液和细胞免疫反应，局部和全身毒性也低于PEI25k ／Mrna［21］。表明 CD-PEI2k ／mRNA 纳米复合物作为一种载体平台，可提高体外转染效率。TAN等［9］合成 1 个由 β-cyclodextrin（β-CD）和支化聚乙烯亚胺构成的共轭结构，CD-PEI（CP）结合物帮助mRNA 分子穿过质膜，从内涵体逃逸，从而保证了高转染效率。

2.3 以单纯纳米颗粒（nanoparticles，NPs）为载体平台 CHAHAL 等［22］开发出一种能够快速反应合成的无佐剂的单剂量树状大分子NPs 疫苗平台，其中的抗原由mRNA 编码。这种NPs 级的mRNA 能够在人上皮细胞系HeLa、鼠和人的原代成纤维细胞中成功表达。将制成NPs 的H1N1 的HA 抗原mRNA注入小鼠体内后，可观察到CD8+T 细胞明显增殖，能诱导小鼠的特异性免疫反应。先天免疫系统在纳米材料与宿主生物的相互作用中起至关重要的作用。研究人员通过与临床相关的如Fe3O4、TiO2、ZnO、CuO 等来研究Toll 样受体（TLRs）的激活。结果表明，NPs 可导致TLR-4 和TLR-6 表达增加，与脂质体诱导水平相当，表明NPs 可刺激宿主体内的先天免疫系统反应［23］。尽管 Fe3O4、TiO2等 NPs 能用于有效的mRNA 传递，但如何将mRNA 定向递送至体内的特定器官、组织和细胞，仍然面临困难和挑战。为获得准确的mRNA 表达量，有研究团队将携带编码Cre 重组酶的mRNA 的NPs 注射至常用的小鼠品系中，可准确报告mRNA 对器官、组织结构和单个细胞的靶向效果［24］，表明其可对体内某个结构或细胞进行定量检测。

3 mRNA 疫苗在疾病防治中的研究进展

3.1 mRNA 疫苗在肿瘤防治中的进展 mRNA 疫苗可进入细胞内，由mRNA 翻译成抗原，从而引发细胞毒性 T 细胞（cytotoxic T lymphocyte，CCL）介导的特异性免疫应答。人工体外合成的肿瘤抗原是应用较为普遍的策略，具有纯度高、特异性强的特点，并且可个性化制备，但目前价格仍然较昂贵［25］。有研究报道使用阳离子脂质辅助的纳米颗粒（cationic lipid-assisted nanoparticles，CLAN）为载体传递 mRNA疫苗治疗恶性T 淋巴瘤，在被注射含编码卵清蛋白mRNA 的小鼠体内产生了较强的特异性肿瘤杀伤T 细胞应答［26］。编码肿瘤相关蛋白的mRNA 可通过电穿孔转染至DC 中，作为一种疫苗可增强肿瘤特异性CD8+T 细胞的多功能性，从而诱发较强的免疫反应［27］。REAP 等［28］研究发现，胶质母细胞瘤患者的治疗靶点为人巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）抗原，在22 例患者中，有17 例患者随机接受CMV-pp65 特异性 T 细胞与 CMV-DC 疫苗（CMVATCT-DC）或CMV-pp65 特异性T 细胞与CMV-saline疫苗（CMV-ATCT-生理盐水），其中接种CMV-ATCTDC 疫苗的患者，IFNγ+、TNFα+、多功能性 CCL3+以及特异性CMV CD8+T 细胞含量显著增加，尽管尚未直接证明其具有治疗肿瘤的能力，但结果表明这是一种有前景的抗肿瘤免疫治疗方法。有学者在黑素瘤和人乳头瘤病毒E7 的体内肿瘤模型中，采用mRNA疫苗能够诱发强大的免疫反应，并且能够抑制肿瘤生长和延长生存期，增强抗肿瘤疗效［29］。

基于mRNA 研发的药物已经成为一种非常有吸引力的新一类生物制剂［30］。抗肿瘤抗体的研究进展可分为裸抗体、单克隆抗体和基因工程抗体3个阶段［31］，单克隆抗体几乎进入生物医学研究的每一个分支。RYBAKOVA 等［32］首次证实了肝脏产生的一种抗体可抑制实体瘤的生长，实验结果还发现，LNPs 可将IVT-mRNA 直接传递至肿瘤，治疗性抗体在肿瘤微环境内或直接在肿瘤细胞内的表达可潜在地增强治疗效果，减少脱靶效应。因此，mRNA 疫苗编码抗体为肿瘤治疗带来了一种新的策略。

3.2 mRNA 疫苗在感染性疾病防治中的进展 通过mRNA 疫苗编码抗体已在感染性疾病防控研究中得到应用。KOSE 等［33］提取出基孔肯雅病毒（Chikv）的单克隆抗体，并将编码该抗体的mRNA 分子输送至小鼠体内，评估小鼠Chikv 感染模型中免疫球蛋白或mRNA 的保护能力。结果表明，mRNA 疫苗具有预防该病毒感染性疾病的功能。尼帕病毒是一种新型的人兽共患病毒，属于RNA 病毒，被感染者出现发热、严重头痛、脑膜炎等症状，给人及动物带来了严重危害［34］。有研究人员通过编码可溶性亨德拉病毒糖蛋白的单剂量LNP 核苷修饰的mRNA 疫苗，在动物实验中可保护高达70%的叙利亚仓鼠免受尼帕病毒的攻击。尽管动物在被病毒攻击前具有被其他情况引发的免疫应答，这些数据仍然为优化尼帕病毒和其他高致病性病毒的mRNA 疫苗接种提供了支持证据并奠定了研究基础［35］。

流感病毒是单链负RNA 病毒，由于其表面存在抗原血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）的多种不同亚型，导致流感病毒具有传染性和变异速度快的特点［36］。PARDI 等［37］使用修饰和纯化后的mRNA 编码流感病毒的高度保守区HA，与LNP 形成HA mRNA-LNP 疫苗，该疫苗在兔、小鼠和雪貂体内均能产生抗体应答，并且能够免受同种或异种流感病毒的感染。除单一抗原外，Moderna 公司公布了其在研项目mRNA-1653 的Ⅰ期临床中期数据，mRNA-1653 由2 段mRNA 序列组成，分别编码2 种病毒的融合蛋白，针对的是人类偏肺病毒和3 型副流感病毒，多mRNA 的协同传递能够产生协同效应，并进一步增强免疫［38］。

2020年，严重急性呼吸综合征冠状病毒2 型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）以较快的传播速度席卷了全球多个国家，上百万人被感染，针对此种传播速度快的病毒，mRNA疫苗凭借其本身的结构特性和生产过程被学者们所关注。Moderna 公司针对 SARS-CoV-2 的 mRNA-1273 疫苗利用SARS-CoV-2 的S 蛋白诱导产生中和抗体。在日本的一项临床数据显示，不同年龄层的志愿者随机接种2 剂100 μg mRNA-1273 或安慰剂，肌肉注射，间隔28 d，结果显示，该疫苗具有一定的安全性，能诱导产生显著的抗SARS-CoV-2 免疫应答［39］。除此之外，辉瑞公司研发的BNT162b2 也是一种针对SARS-CoV-2 的mRNA 疫苗，临床试验结果显示其能引起强烈的免疫反应且显著促进血清中中和抗体的产生［40］。

狂犬病是一种由狂犬病病毒导致的急性传染病，人体一旦感染，致死率几乎100%［41］。2017年，Cure Vac 公司对其第1 代基于mRNA 的狂犬病预防性疫苗CV7201 的安全性及免疫原性进行了评估，结果表明，CV7201 有较好的安全性，并且具有合理的耐受性，可诱导针对病毒抗原的可增强型功能性抗体［42］。最近，研究人员对新型狂犬病自扩增基因疫苗在大鼠体内重复给药和生物分布的非临床安全性进行了评价，结果表明，动物对该疫苗有很好的耐受性，该研究结果进一步证明了mRNA 疫苗在感染性疾病防治方面的可行性及优点［43］。

mRNA 疫苗除在病毒性感染方面有一定的研究进展外，在寄生虫感染方面也有了新的研究进展。巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）是真核生物中存在的一种影响多种免疫反应的细胞因子，其活化／ 失活与多种疾病相关。动物被寄生虫感染后，MIF 不仅在宿主体内表达，还可被一些寄生虫表达并释放至宿主体内［44］。疟原虫等寄生虫可产生一种MIF 的同源物——疟原虫巨噬细胞迁移抑制因子（plasmodium macrophage migration inhibitory factor，PMIF），疟原虫释放 PMIF可减弱机体的免疫应答，并促进宿主对疟疾的炎症反应［45］。采用编码PMIF 的mRNA 疫苗免疫小鼠后，小鼠体内的特异性免疫反被激活，体内特异性CD4+T 细胞和抗体明显增多，表明可通过接种mRNA疫苗来提高机体对寄生虫等感染性疾病的免疫保护能力［46］。

3.3 mRNA 疫苗在自身免疫性疾病治疗中的的进展 自身免疾性疾病是机体对自身抗原产生强烈的免疫应答而导致的疾病，其发病原因和发病机制均较复杂，因此近年来也出现多种新的策略来治疗自身免疫性疾病。多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是以中枢神经系统白质炎性脱髓鞘病变为主要特点的自身免疫性疾病，其主要发病机制为T 细胞自身对髓磷脂抗原的免疫［47］。有学者利用编码突胶质细胞糖蛋白（myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG）的mRNA 电穿孔至小鼠易嗜性树突状细胞（tol DC）中，产生小鼠MOG，利用以MOG 作为抗原负载的tol DC 治疗自身免疫性脑脊髓炎的小鼠临床评分稳定，而未使用抗原负载或仅使用载体的小鼠临床评分恶化，这可能成为mRNA 电穿孔进入tol DC 治疗多发性硬化症的个性化治疗的基础［48］。

哮喘等过敏反应性疾病是在全世界范围内具有较高发病率的自身免疫相关性疾病，预防性和治疗性疫苗的研发是此类疾病防治研究的热点。目前的研究进展表明，质粒DNA 及mRNA 疫苗均能够预防一些Ⅰ型过敏反应，由于mRNA 所特有的一些生物学结构及特点，使其具有较高的安全性，更符合健康儿童疫苗接种的严格安全要求［49］。已有研究表明，通过过敏原的提取，将编码过敏原的mRNA 注入到细胞后会诱导Th1 和T 调节细胞应答，能调节过敏性 Th2 细胞的反应［50］，表明mRNA 疫苗能够针对过敏反应性疾病产生一定的免疫反应。

4 展 望

近年mRNA 疫苗在结构修饰和递送系统优化等方面取得了重大进展，在多种肿瘤以及感染性疾病防治方面的应用技术逐步发展和成熟，多种mRNA疫苗已进入临床试验。但mRNA 疫苗在研发中仍然面对一些问题和挑战需要克服，如mRNA 进行一系列结构改造和优化后，体外试验的稳定性有所提高，但进入人体后如何保持较高的稳定性尚需进一步探讨。此外，现有载体材料在动物实验中已取得较好效果，这些递送体系在人体中的应用效果仍需积累更多评估数据。另外，mRNA 对一些类型细胞的转染效率仍然不高，通过电穿孔法或使用脂质体复合物和NPs 作为载体在提高转染效率的同时，也存在损伤细胞或抗原递送效率变化的问题。在较多的研究中，mRNA 疫苗在人体诱导的免疫反应强度常常低于动物模型，如何通过修饰改造mRNA 的结构以增强蛋白的表达，从而增强抗原特异性免疫反应是一个发展方向。除此之外，个性化疫苗技术日趋成熟，而mRNA 疫苗能够快速合成的生物特性使其非常适合个性化疫苗的制备。因此，在针对癌症等异质性较高的疾病时，mRNA 个性化疫苗的制备具有良好的前景；在针对其他疾病时，如何利用mRNA 疫苗在体内诱导产生中和抗体也是一个值得探索的方向。