miR-155调控THP-1巨噬细胞炎症的作用机制

谭仕廉，李艳丽，郭 乐，申元英

0 引 言

炎症反应是机体对于各种刺激的一种防御性反应，也是临床上常见的一种病理过程，可发生于机体各部位的组织和器官。多种疾病的发生发展与炎症反应密切相关，比如肿瘤、动脉粥样硬化、炎症性肠病、阿尔兹海默症和Ⅱ型糖尿病等[1-2]。较弱的炎症反应会导致病原体的持续感染，而过度的炎症反应又能造成机体损伤，因此平衡机体炎症反应对各种疾病的防治意义重大。巨噬细胞作为固有免疫系统的一个重要组成部分，在保护细胞免受病原体入侵、清除细胞碎片、调节炎症反应中的作用不可小觑。有研究表明炎症反应与巨噬细胞表达分泌的炎症介质紧密相关，因此严格调控巨噬细胞的活化可为炎症性疾病提供新的防治方案[3]。

微小RNA(microRNA，miRNAs)是进化上高度保守且广泛存在于真核生物中的一类非编码单链小RNA分子，与信使RNA (messenger RNA，mRNA)结合抑制靶基因的表达或翻译来发挥转录后调控作用[4]。研究发现炎性组织中普遍存在多种miRNAs表达异常，且与组织的炎症反应失调、免疫功能紊乱等密切相关[5]。miR-155是一个典型的多功能miRNA，参与了炎症、免疫、肿瘤及血细胞生成等多种生物学过程[6]。已有研究表明miR-155在巨噬细胞炎症反应中被诱导，但其调控巨噬细胞炎症的作用及具体机制尚不清楚[7]。本研究以LPS诱导THP-1细胞来源的巨噬细胞为体外炎症细胞模型，旨在探讨miR-155调控巨噬细胞炎症反应中的作用及其机制，为防治炎症性疾病的发生和发展提供新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料人单核细胞THP-1(TCHu 57)由中国科学院细胞库提供。脂多糖(LPS)(055:B5)购于爱必信(上海)生物科技有限公司；RPMI1640培养基购自corning公司；胎牛血清购于Gibco公司；佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯 ( Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA) 购于大连美仑生物技术有限公司；RNA-easyTMIsolation Reagent、HiScript©III 1st Strand cDNA Synthesis Kit、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix均购于诺唯赞公司；miRNA检测外参、miRcute Plus miRNA First-strand cDNA Kit、miRcute Plus miRNA qPCR Kit均购于天根生化科技(北京)有限公司；LipofectamineTM2000 Reagent 购于Thermo Fisher Scientific公司； miRNA-155 mimics、mimics NC、siRNA-SOCS1和siRNA-NC均由上海生工生物公司设计合成；BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)购于碧云天生物技术公司；β-actin一抗、SOCS1一抗、羊抗兔二抗均购于Cell Signaling Technology公司。

1.2方法

1.2.1 细胞培养THP-1单核细胞培养在含有10% 胎牛血清、1% 双抗、1% 非必需氨基酸的RPMI1640培养基中，于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养；细胞处于对数生长期且状态良好时加入浓度为100 ng/mL的PMA，诱导48 h 后，细胞由悬浮状态转为贴壁状态，表明细胞已诱导分化为THP-1巨噬细胞[8]。

1.2.2细胞转染按照LipofectamineTM2000试剂说明书将预制好的转染复合物分别加入各组THP-1巨噬细胞中，转染24 h后再使用浓度为100 ng/mL的LPS诱导细胞1.5 h。实验分组：①miRNA转染：空白组、LPS组、miR-155 mimics+LPS组、mimics NC+LPS组；②siRNA转染：对照组、LPS组、siRNA-SOCS1+LPS组、siRNA-NC+LPS组。并用qRT-PCR检测各组细胞中miRNA-155及TNF-α、IL-8的相对表达量；ELISA法检测转染细胞上清中TNF-α、IL-8的含量；Western blot法分析转染细胞 SOCS1蛋白表达水平。

1.2.3生物信息学分析miR-155通过海绵作用吸附内源性RNA分子调节靶基因表达。本研究运用Targetscan (http://www.targetscan.org/vert_72/)数据库，以“miR-155”为关键词，检索其潜在靶基因。

1.2.4实时荧光定量PCR(qRT-PCR)采用TRIzol法提取各组THP-1巨噬细胞总RNA后，按照转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA，再用SYBR qPCR试剂盒扩增上述cDNA并分析其对应mRNA的相对表达量。该扩增体系为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸30 s，一共40个循环。用2-ΔΔCT法计算目的基因的相对表达量。每个实验独立重复进行3次，每个样品均设置3个复孔。GAPDH上游引物序列为5′-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA，下游为3′-GTGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT；TNF-α上游引物序列为5′-TGTAGCCCATGTTGTAGCAAACC，下游为3′-GAGGACCTGGGAGTAGATGAGGTA；IL-8上游引物序列为5′-ATGACTTCCAAGCTGGCCGTGGCT，下游为3′-TCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTCT；SOCS-1上游引物序列为5′-GACGCCTGCGGATTCTACTG，下游为3′-GGCCATCTTCACGCTAAGGG；U6上游引物序列为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA，下游为3′-AACGCTTCACGAATTTGCGT；miR-155引物序列为(5′-3′)CGCGCGCGCTTAATGCTAATCGTGA。

1.2.5ELISA按照TNF-α、IL-8 ELISA试剂盒操作步骤说明，检测各组细胞上清在450nm处的吸光值，根据吸光值绘制标准曲线，分别计算出细胞上清中TNF-α、IL-8的含量。

1.2.6蛋白免疫印迹(Western blot)用RIPA裂解细胞并提取总蛋白，BCA蛋白定量检测试剂盒进行定量，经12.5% SDS-PAGE 120 V电泳2 h，再转移至PVDF膜，以5% 脱脂奶粉封闭1 h后用PBS漂洗3次，每次5 min，加入特异性一抗于4 ℃过夜孵育。次日用 PBST 漂洗3次，每次5 min 后，加入二抗室温孵育1 h，再用PBST漂洗3次，每次5 min，经ECL曝光成像。使用Image J软件对条带进行半定量分析。

2 结 果

2.1 miR-155在LPS诱导THP-1巨噬细胞中的表达qRT-PCR结果显示，与空白组相比，THP-1巨噬细胞在LPS诱导后miR-155表达明显上调(P<0.05)。表明miR-155在LPS诱导的巨噬细胞炎症中表达升高，见图1。

与空白组相比，*P<0.05

2.2miR-155对LPS诱导THP-1巨噬细胞炎症因子的影响qRT-PCR结果显示LPS处理后，TNF-α、IL-8在mRNA水平较空白组表达升高(P<0.01)，miR-155 mimics+LPS组较LPS组TNF-α、IL-8进一步升高(P<0.05)，说明miR-155促进LPS诱导的TNF-α、IL-8的转录表达。ELISA结果显示LPS诱导后，细胞上清中TNF-α、IL-8较空白组分泌增加(P<0.01)，miR-155 mimics+LPS组较LPS组进一步增加(P<0.05)，说明miR-155提高了LPS诱导的TNF-α、IL-8的分泌。表明miR-155可促进LPS诱导的THP-1巨噬细胞炎症反应，见图2。

1：空白组；2：LPS组；3：miR-155 mimics+LPS组；4：mimics NC+LPS组

2.3SOCS1是miR-155在THP-1巨噬细胞炎症中的靶基因经TargetScan数据库预测，SOCS1可能是miR-155的作用靶点之一，见图3。qRT-PCR结果显示转染miR-155 mimics后，THP-1巨噬细胞中miR-155 mRNA明显升高(P<0.05)，而SOCS1 mRNA显著下调(P<0.05)，见图4。表明miR-155可靶向负调控SOCS1的表达。

图 3 TargetScan数据库预测miR-155靶向调控SOCS1的序列

1：空白组；2：miR-155 mimics组；3：mimics NC组

2.4SOCS1沉默对LPS诱导THP-1巨噬细胞炎症因子的影响结果显示，与对照组相比，siRNA-SOCS1+LPS组中THP-1巨噬细胞SOCS1在基因水平和蛋白水平的表达都显著降低(P<0.05)，见图5。说明沉默SOCS1的THP-1巨噬细胞构建成功。接着使用LPS诱导上述SOCS1沉默模型细胞，结果显示，与LPS组相比，siRNA-SOCS1+LPS组中THP-1巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-8 mRNA的表达升高(P<0.05)，而SOCS1蛋白的表达降低(P<0.05)。说明SOCS1在LPS诱导的THP-1巨噬细胞炎症中具有负向调节炎症反应的作用。见图6。

2.5miR-155靶向作用SOCS1调控THP-1巨噬细胞炎症Western Blot结果显示，与LPS组相比，miR-155 mimics+LPS组中SOCS1蛋白表达明显降低(P<0.05)，见图7。以上实验共同表明miR-155在LPS诱导的巨噬细胞炎症反应中发挥促炎作用，而这一作用可能是通过降低SOCS1的表达实现的。

1：对照组；2：siRNA-SOCS1+LPS组；3：siRNA-NC+LPS组

1：对照组；2：LPS组；2：siRNA-SOCS1+LPS组；3：siRNA-NC+LPS组

1：空白组；2：LPS组；3：miR-155 mimics+LPS组；4：miR-155 mimics组；5：mimics NC+LPS组；6：mimics NC组

3 讨 论

LPS是革兰阴性杆菌细胞壁的主要成分，可以被包括单核细胞、巨噬细胞在内的多种组织细胞中Toll样受体4(Toll-like receptors 4, TLR4)直接识别，诱发炎症细胞因子和相关炎症介质的大量释放，进而引起全身炎症反应[9]。Toll样受体( Toll-like receptors，TLRs) 是固有免疫系统中炎症反应的主要受体之一，TLR信号通路的过度激活会导致机体炎症失衡[10]。因此LPS常被用于构建体内外炎症模型[11-12]。THP-1细胞有类似人原代单核细胞的形态和功能特征，比原代细胞更易在实验室中培养和扩增，被广泛用于单核细胞和巨噬细胞相关的机制研究[8]。

巨噬细胞作为吞噬细胞和专职抗原提呈细胞，分布于全身不同的组织中，如皮肤、肝、脑、骨组织、胃肠道、胰腺、肺、脾和肾等[13]。有研究指出巨噬细胞是银屑病皮损中主要浸润的炎性细胞，巨噬细胞内IL-1β、IL-12、IL-23、CCL5及CCL20基因及其蛋白产物表达增加，从而介导银屑病皮损中的炎症反应[14]。激活后巨噬细胞可发挥高效的抗原呈递作用，同时释放大量TNF-α和IL-6，直接发挥促炎作用或促进 Th1 型免疫应答引起炎症反应，参与诱导溃疡性结肠炎的形成[15]。由此可见，巨噬细胞是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁，也是调节机体炎症反应过程中的重要环节。

自2000年在哺乳动物中发现第一个miRNA以来，大量的研究发现miRNAs不仅是固有免疫和适应免疫系统发展和功能的重要因素[16]，还参与了许多人类疾病的发病机制，其中包括免疫疾病、癌症、心血管疾病和神经系统疾病，且特定的miRNAs变化与不同的人类疾病紧密相关[17]。miR-155在暴露于广泛炎性介质后上调，且可能参与JNK/MAPK和NF-κB信号通路调控，被认为是一种重要的亲炎症miRNA[7]。有团队观察了miR-155在LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应中的表达变化，发现miR-155和促炎因子IL-6同向增高，两者可能存在一定的关联性[18]。miR-155在THP-1巨噬细胞中增强单钠尿酸盐晶体引起的IκB蛋白降低、磷酸化Akt蛋白增加，促进了单钠尿酸盐晶体诱导的TNF-α和IL-1β的产生，在急性痛风性关节炎中发挥促炎作用[19]。在炎症早期，由血液中招募而来的单核细胞分化为炎性M1型巨噬细胞，对抗原产生适当的免疫反应；当炎症进入消退阶段后，巨噬细胞检测和吞噬凋亡的中性粒细胞，以控制继发性坏死和炎症的进一步加剧，此时巨噬细胞表型转为M2型。有研究表明miR-155是一种强有力的调节因子来调节巨噬细胞极化，miR-155水平在巨噬细胞M1-M2极化时显著下降，但在巨噬细胞M2-M1极化时升高[20]。同样的，Li等[21]发现miR-155缺乏可导致促炎的M1型巨噬细胞转变成抗炎的M2型巨噬细胞，并抑制CD4+T细胞向Th1和Th17极化，从而缓解炎症反应。

巨噬细胞激活后大量释放包括TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、CCL-2/MCP-1等一系列炎性细胞因子[22-23]。TNF-α是巨噬细胞在活化后最先产生的细胞因子之一，TNF-α又会诱导其他炎症因子如 IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、 IL-12 等的分泌，在整个炎症网络中起到“导火索”和“催化剂”的作用[24]。在我们的研究中，LPS诱导THP-1巨噬细胞炎症后， TNF-α和IL-8在转录组水平和蛋白水平均增加，miR-155进一步提高了两种炎症因子的表达水平。为了探索miR-155促进炎症的调控机制，我们结合已知文献和TargetScan数据库预测，选定SOCS1为miR-155调控炎症的下游靶基因。SOCS1是一种调节细胞信号传导通路的蛋白，也是一种有效的分子开关，它通过负反馈调节细胞信号的传导通路，如JAK激酶和活化的细胞因子受体复合物，调节细胞发展、炎症过程和免疫反应来发挥生物学功能[25]。Nakagawa团队指出SOCS1参与了LPS反应的负调控[26]，Kinjyo等人证实了SOCS1/JAB是LPS诱导巨噬细胞激活的负调节剂[27]。在LPS诱导的急性肺损伤中，肺泡巨噬细胞衍生的miR-155靶向下调了SOCS1表达，显著加重了大鼠和小鼠的肺部炎症[28]。在本研究中，SOCS1在miR-155过表达的THP-1巨噬细胞中表达减少，这表明SOCS1可被LPS诱导THP-1巨噬细胞炎症中的miR-155负调控。以上生物信息学分析和功能研究共同证明了SOCS1是LPS诱导的THP-1巨噬细胞中miR-155的靶基因。

综上所述，我们的数据表明miR-155能够上调THP-1巨噬细胞中炎症因子TNF-α、IL-8的表达，其潜在机制之一是通过靶向降低SOCS1蛋白的表达，促进LPS所致的THP-1巨噬细胞炎症反应及免疫应答。因此，miR-155的改变可作为炎症性疾病的监测指标之一，抑制miR-155以防止巨噬细胞持续激活造成的不可逆组织损伤，为炎症性疾病的防治提供了一个潜在治疗靶点。为进一步阐明miR-155调控巨噬细胞炎症反应的作用机制，后续应探索其介导炎症反应的下游信号通路，同时关注miR-155在巨噬细胞炎症中是否存在更多的靶向关系，更好的为炎症性疾病的防治提供理论基础。