一例罕见AB类孟买血型的鉴定分析

陈碧乐，洪俊英，刘梦召，谢作听

温州医科大学附属第一医院输血科，浙江 温州 325015

类孟买血型是H血型系统的一种稀有表型[1]，其主要特征为红细胞上H抗原部分或完全缺失/转化，红细胞表面缺乏ABH抗原，而在唾液等分泌液中却可以找到ABH血型物质[2]，血浆中常存在抗H抗体。近年来，国内外关于类孟买血型的报道逐渐增多，其中以A、B类孟买血型居多，而AB类孟买血型较少见[3-6]。本研究对一例由FUT1 等位基因碱基缺失导致H抗原不表达形成AB类孟买血型的家系进行血型血清学鉴定和基因突变分析，初步探讨其分子生物学机制。

1 对象和方法

1.1 对象 先证者，女，35岁，汉族，体健，既往无输血史，因健康体检于2021年10月来温州医科大学附属第一医院体检中心就诊并申请血型鉴定，血型血清学检测结果疑似其血型为类孟买型。参与本次调查的家系成员包括其母亲、哥哥、姐姐及两个女儿的血液进一步进行血型及基因检验。标本采集及实验研究前严格履行知情同意及伦理论证流程。

1.2 试剂及仪器 IH-1000全自动血型鉴定仪（美国BIO-RAD公司）；专用离心机（台湾贝索企业有限公司，型号2005-2）；OLYMPUSCX21普通光学显微镜（日本欧林巴斯公司）；微柱凝胶卡（瑞士DiaMed公司，批号5007267709）；单克隆抗A、抗B试剂（上海血液生物医药有限责任公司，批号20190915）；人ABO反定型红细胞（北京金豪制药股份有限公司，批号20201001024）；抗-H、抗-Lea、抗-Leb试剂（德国GmbH公司，批号分别为OHM142-2、OLeaM121-1、OLebM109-1）；不规则抗体筛选试剂（江苏力博医药生物技术股份有限公司，批号202010020）；不规则抗体特异性鉴定谱细胞（匈牙利REAGENSKft公司，批号732021）；3%O型脐带血洗涤红细胞（本室自制）。

1.3 血型血清学实验

1.3.1 血清学实验：ABO血型正反定型，采用盐水介质试管法和微柱凝胶抗人球蛋白法；红细胞上弱A、B、H抗原检测，采用4℃-吸收-56℃-放散法；唾液中可溶性A、B、H血型物质检测，采用中和抑制试验；Lea、Leb抗原检测，采用盐水介质试管法[7]。

1.3.2 红细胞血型不规则抗体筛查与鉴定：采用盐水介质试管法和微柱凝胶抗人球蛋白法，确定抗体免疫球蛋白类型和抗体特异性。若抗体特异性疑为IgM类抗H或抗HI抗体时，加做O型脐带血洗涤红细胞反应；若O型脐带血洗涤红细胞不凝集时判为抗HI抗体，否则判为抗H[8]。

1.3.3 DNA抽提和PCR扩增：用美国Invitrogen公司血液基因组DNA提取试剂盒，提取先证者及其家系成员外周血标本基因组DNA。采用PCR分别扩增ABO基因、FUTl基因和FUT2基因，引物序列见表1，扩增条件参照文献报道[6]。

1.3.4 PCR产物直接测序：采用DNA琼脂糖凝胶纯化试剂盒（美国Invitrogen公司）纯化ABO 基因、FUTl基因和FUT2 基因扩增的PCR产物，将纯化PCR产物用作测序反应DNA模板，在ABI-3100Avant测序仪检测分析。用Chromas2.33软件阅读图谱，GeneRunnerversion3.05 软件拼合、比对和分析测序结果，将测序结果与人类红细胞血型基因数据库基因序列进行比对。

表1 ABO、FUT1、FUT2 引物序列及参考基因序列号

2 结果

2.1 血型血清学实验结果

2.1.1 ABO血型正反定型：先证者微柱凝胶法正反定型结果不符，盐水介质试管法正反定型结果存疑（表现为反定型凝集强度异常）；其他家系成员两种方法正反定型结果相符，见表2。

2.1.2 红细胞上弱A、B、H抗原检测：先证者红细胞未检测到H抗原，红细胞放散液检到A抗原（未检到B抗原），见表2。

2.1.3 先证者红细胞不规则抗体筛查和鉴定：经盐水介质试管法和微柱凝胶抗人球蛋白法，证明存在IgM类抗HI抗体，见表2。

2.1.4 红细胞Lea、Leb抗原检测：先证者及其家系成员Lewis血型均为Lea（-）Leb（+），见表2。

2.2 唾液中可溶性血型物质A、B、H检测结果 先证者唾液中检到A、B、H血型物质，可判定先证者ABH血型物质为分泌型。其家系成员唾液中检到的ABH血型物质与ABO正定型检到的抗原一致，见表2。

2.3 ABO、FUT1 和FUT2 基因检测结果

2.3.1 ABO基因直接测序结果：先证者ABO基因型为：ABO*A1.02/B.01，其ABO糖基转移酶基因第6及7外显子序列为：c.467C＞T、c.297A＞G、c.526C＞G、c.657C＞T、c.703G＞A、c.796C＞A、c.803G＞C和c.930G＞A，证实先证者血型为AB型。

表2 先证者及其家系成员的血型血清学结果

2.3.2 FUT1 和FUT2 基因测序结果：直接测序显示先证者FUT1 基因有2 处杂合缺失突变，分别位于编码区序列第551～第552位碱基AG杂合缺失突变（c.551-552delAG）和第880～第882位碱基TT杂合缺失突变（c.881-882delTT），因此推测同源染色体上的两个等位基因H都各自发生了缺失突变；其母亲、姐姐、大女儿和小女儿FUT1 基因均为c.881-882delTT杂合缺失突变，哥哥为c.551-552delAG杂合缺失突变，均为H/h基因型，能表达H抗原。先证者FUT2 基因测序结果存在c.357C＞T纯合多态性。测序结果见图1。

图1 先证者FUT1 基因测序结果（A、B）及FUT2 基因测序结果（C）

3 讨论

人类H血型物质的表达与H基因（FUT1）和Se基因（FUT2）密切相关，且与ABO基因、Lewis基因（FUT3）存在一定关联。ABO 基因位于9号染色体，FUT1、FUT2和FUT3均位于19号染色体。FUT1编码II型α-1，2-L-岩藻糖基转移酶，可催化II型H前体物质合成红细胞上的H物质；FUT2 编码可催化分泌液中的I型H前体物质合成可溶性H物质，故FUT1 或（和）II型α-1，2-L-岩藻糖基转移酶缺乏或突变时，会影响红细胞H物质的表达，而FUT2 或（和）I型α-1，2-L-岩藻糖基转移酶缺乏或突变时，会影响分泌液中H物质的表达。H抗原是A、B抗原形成的前体物质，当H抗原缺失或突变，可导致红细胞上A、B抗原合成障碍，最终形成类孟买血型[6]。

类孟买血型是一种罕见的红细胞表型，在中国人群中的比例总体较低，约为十几万分之一[9]，但在中国台湾比例为1/8000～1/10000，中国香港则为1/15620[10-11]。在我国大陆主要见于南方地区，其中福建地区频率大约为1/8500，而云南少数民族拉祜族中的频率比较高，达2.2%[12]。中国人群中常见的类孟买血型多为分泌型，其FUT1基因型为h/h，其中常见的FUT1基因突变有h1（c.551-552delAG）、h2（c.881-882delTT）、h3（c.658C＞T）等。研究表明[13-14]，多数类孟买血型为FUT1 基因纯合突变引起，少数由复合杂合突变引起。本例先证者为类孟买血型复合杂合突变，其FUT1 基因型为h1h2。

本实验通过血型血清学发现先证者正定型为弱A型，反定型为Ac2+、Bc1+，血型结果表现为正反定型不符。进一步细胞吸收放散试验也只检测到弱A抗原，分析原因可能因先证者为分泌型，使血浆中少量H抗原吸附到红细胞上，并继续连接α-半乳糖。ABO基因分析显示，先证者ABO血型的基因型为ABO*A1.02/B.01。FUT1基因分析显示，先证者存在双杂合缺失突变，分别为c.551-552delAG杂合缺失突变和c.881-882delTT杂合缺失突变。有文献报道[15-16]，上述两种突变均导致阅读框架发生移码，在氨基酸翻译过程中提前出现终止密码子，形成截短的α-1，2-L-岩藻糖基转移酶，使酶活性大大减低，从而不能有效合成H抗原（即基因型h/h）。FUT2 基因分析显示，先证者存在c.357C＞T纯合多态性，此位点属无意义突变，因未改变编码的天冬酰胺，从而不影响α-1，2-岩藻糖基转移酶活性[17]，故先证者仍表现为分泌型。

该家系调查显示，先证者的母亲、姐姐、哥哥和两个女儿均为单链FUT1 基因突变携带者，符合类孟买血型隐性遗传方式，只要存在一个有功能的FUT1 等位基因（基因型H/H或H/h），红细胞即可表达H抗原[18]。因此，该家系其他成员的ABO血型表型均正常。先证者的母亲和姐姐FUT1 基因均为c.880-882delTT杂合缺失突变，表明先证者和其姐姐FUT1 基因突变来自其母亲；其哥哥FUT1 基因为c.551-552delAG杂合缺失突变，故推测可能来自其父亲。由于条件受限，本研究未能获取先证者父亲血液，故无法对其基因突变位点进行直接验证。

类孟买血型红细胞上只有微量A和（或）B抗原，在常规血型血清学检测中很难检测到，因此常被误定为其他血型。本研究通过血型血清学结合分子生物学技术，家系调查，探讨了AB类孟买血型的分子生物学机制，为类孟买血型的正确鉴定和安全输血提供了实验依据。