G蛋白信号调节因子-13通过调控β-catenin抑制结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭

项友群，方冠，金亦翔，杨凯，潘贻飞

温州医科大学附属第一医院结直肠肛门外科，浙江 温州 325015

结直肠癌（colorectalcancer, CRC）是世界范围内最常见的消化系统肿瘤之一[1]。2015 年我国CRC新发病例近38万例，病死近19万例，发病率和病死例数均居世界首位[2]。CRC的进展通常伴随着癌基因和抑癌基因的突变，表达量的变化以及表观遗传学变化等[3-4]。虽然对CRC进展过程中基因水平的表达调控已有了广泛的研究，但是CRC在分子水平的发生发展机制仍有待阐明。明确CRC增殖、迁移和侵袭的相关分子与相关信号通路，对于CRC的诊断与治疗具有重要的意义。G蛋白信号调节因子-13（regulatorofGproteinsignaling13, RGS13）基因位于人类1号染色体长臂3区1带，编码19.1kDa的蛋白质。RGS13是Gαi和Gαo的GTPase激活蛋白，使结合的GTP转变为GDP，从而调节G蛋白的活性来抑制G蛋白的信号转导[5-6]。作为一个与细胞信号通路密切相关的因子，其在肿瘤发生发展中的作用尚不完全清楚。本研究通过TCGA数据库发现RGS13在人类CRC组织中低表达，并在CRC临床组织样本和细胞系中进行验证，探究了其在CRC细胞增殖、迁移和侵袭中的作用及其可能的下游机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：结直肠正常细胞系FHC（CRL-1831）购自美国模式培养物集存库（Americantypeculturecollection, ATCC）；CRC细胞系SW480（CBP60019）、SW620（CBP60036）、DLD-1（CBP60037）和HCT116（CBP60028）购自南京科佰生物科技有限公司，均经过STR分型鉴定且鉴定无误。细胞均使用ATCC推荐的培养基培养，培养基均补充有10%胎牛血清、1%双抗和1%L-谷氨酰胺，并置于37℃、5%CO2细胞培养箱。

1.1.2 质粒：β-catenin、RGS13过表达质粒购自武汉淼灵生物科技有限公司。慢病毒法构建稳定转染的细胞株。将适量293T细胞接种于6孔板中，使用PolyJetTMDNA体外转染试剂按照说明书操作。使用工作浓度的嘌呤霉素筛选稳定转染的细胞。

1.1.3 抗体：RGS13抗体（PA5-68626）购自美国ThermoFisher公司，β-catenin（51067-2-AP）、Flag（66008-4-Ig）、GAPDH（60004-1-Ig）抗体购自美国Proteintech公司。

1.1.4 引物：RGS13引物（正向：5’-AGATTTACATCCAGCCACAGTCCC-3’，反向：5’-GACTTTAGAAATCTGGGGTAGGAAT-3’），细胞周期蛋白-D1（cyclinD1，CCND1）引物（正向：5’-GCTGCGAAGTGGAAACCATC-3’，反向：5’-CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3’），c-Myc引物（正向5’-CAGTAGCACTGCGCGATAGA-3’，反向：5’-TGCTTCAGACCTTCGTGACC-3’），基质金属蛋白酶7（matrixmetalloproteinases7，MMP7）引物（正向：5’-GAGT GAGCTACAGTGGGAACA-3’，反向：5’-CTATGACGCGGGAGTTTAACAT-3’），均由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.1.5 临床组织样本：实验使用的134对CRC组织及其癌旁组织样本取自温州医科大学附属第一医院结直肠肛门外科，均为通过病理学检测确诊为CRC，通过外科手术治疗取得的临床组织。所有程序均通过温州医科大学附属第一医院伦理委员会审查[编号：（2021）第（063）号]。

1.1.6 数据库组织样本：下载TCGA 数据库（https://tcga-data.nci.nih.gov/）中的结肠癌（TCGA-COAD）的exon-SeqV2测序数据（Level3，rawcount）和临床数据。其中，数据库中可用于差异分析的CRC与癌旁配对样本共41对，用于生存分析含无病生存期（disease-freesurvival, DFS）信息的样本共379例。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色：将制作好的切片脱蜡、复水、抗原修复，1×Tris缓冲液（1×TBS）清洗后3%H2O2封闭30min后用5%BSA封闭30min，甩去后4℃孵育一抗过夜，回收一抗，然后37℃下孵育二抗30min，清洗后链霉亲和素-生物素复合物（SABC）孵育30min，滴加DAB显影液于组织上显色合适时间，ddH2O终止后苏木素染色，自来水静置10min，脱色和透明后制片，光学显微镜下观察蛋白的染色情况，软件分析单位面积下的IOD值（阳性着色）。

1.2.2 蛋白质印迹法（Westernblot）：配好10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）胶后，收集细胞，处理并定容蛋白样品，上样20μL，浓缩胶80V电泳15min，分离胶120V电泳1.5h，使用快速转膜仪转膜15min，5%脱脂牛奶封闭1h，1×TBS清洗PVDF膜后4℃孵育一抗过夜后回收一抗，4℃孵育二抗3h后回收二抗，使用ECL显影法显影。Typhoon7000扫膜仪扫描PVDF膜，保存分析图像结果。

1.2.3 实时荧光定量聚合酶链反应（real-timequantitativepolymerasechainreaction, RTqPCR）：TRIzol法提取总RNA并使用SuperScriptTMIV反转录试剂盒，按照说明书反转录出cDNA后，使用SYBRGreen试剂盒按照说明书进行qPCR，以GAPDH作为内参。最后置于Q6qPCR仪中检测并用2-ΔΔCt法分析。

1.2.4 ATP细胞活力检测：先细胞种板，96 孔板中每孔加入1000个细胞，用0.1%培养基处理细胞12h。之后按照对应天数用10%培养基培养细胞，弃培养基后将各25μL的ATP试剂和PBS混合加入孔中。振荡后1200r/min离心5min。静置后转至黑色96孔板，加样后生物发光仪检测，保存数值并分析结果。

1.2.5 软琼脂克隆集落形成实验：先在6孔板中铺2mL下层琼脂胶，凝固后铺1mL混有1×104个细胞的上层胶，6孔板放入37℃、5%CO2培养箱中培养。用倒置显微镜5倍镜拍照并计数含32个细胞以上的克隆，计算细胞集落数形成率并分析结果。

1.2.6 细胞迁移侵袭实验：专用小室上室加400μL0.1%FBS培养基，下室加700μL完全培养基。上室接种细胞5×104个，培养24h后，弃去培养基，之后用4%多聚甲醛固定细胞20min，甲醇通透20min，吉姆萨染色液染色20min，擦去未从上室穿出到下室的细胞，倒置显微镜拍照计数并统计分析。

1.2.7 蛋白降解实验：先细胞种板，6孔板中每孔加入3×105个细胞，细胞贴壁后分别用0.1%FBS的培养基、MG132试剂（10mmol/L）处理细胞12h、8h后，加入放线菌酮（cycloheximide, CHX）试剂（50μg/mL）分别处理细胞0h、3h、6h、12h，Westernblot检测蛋白降解情况。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS18.0统计软件进行数据分析，用GraphPadPrism5.0软件作图。计量资料以±s表示，两独立样本数据比较采用非配对t 检验，两配对样本数据比较采用配对t 检验，多组间数据分析采用单因素方差分析，生存分析采用Log-rank法，非正态分布计量资料采用非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RGS13在CRC组织与细胞系中表达降低且与CRC患者的分期和无病生存期显著相关 本研究选取了TCGA数据库中41对配对的CRC组织样本和癌旁正常组织样本的转录组测序结果，发现在CRC组织样本中RGS13的mRNA表达水平显著低于癌旁正常组织（P＜0.01），见图1A；对收集到的134对CRC临床组织样本进行RT-qPCR实验，得到了与上述分析一致的结果（P＜0.01），见图1B。在蛋白水平上，本研究通过对134对CRC临床组织样本进行免疫组织化学实验并分析，发现在CRC组织样本中，RGS13蛋白表达量显著低于癌旁正常组织（P＜0.01），见图1C。为了方便进一步研究RGS13的功能，本研究在常用的CRC细胞系及正常结直肠细胞系中进行了Westernblot检测。结果表明，相较于正常结直肠细胞系FHC，在HCT116、SW480等CRC细胞系中RGS13的蛋白表达水平均显著下调，见图1D。

为了进一步研究RGS13的表达量与CRC恶性程度的关系，本研究对134对临床组织免疫组织化学实验的结果按照病例的临床分期分组并分析。结果表明，CRC低分期（I+II期，70例）病例的RGS13的蛋白表达量高于CRC高分期（III+IV期，64例）病例的RGS13的蛋白表达量（P＜0.01），见图1E。为了进一步阐明RGS13的表达量与CRC患者预后的关系，本研究对TCGA数据库中的379例CRC患者的DFS数据进行分析，发现RGS13高表达组（相对表达量大于均值0.758，86例）的DFS显著高于RGS13低表达组（相对表达量小于均值0.758，293例，P＜0.01），见图1F。

2.2 RGS13的下调可显著促进CRC细胞的增殖、迁移与侵袭 为了在生物学功能上验证RGS13的下调是否促进CRC的恶性进展，本研究选用RGS13下调较为显著的HCT116和SW480细胞系，构建了RGS13的过表达稳转细胞株，见图2A。ATP实验表明，过表达RGS13的HCT116和SW480细胞，其增殖指数显著低于对照空载细胞（P＜0.01），见图2B、图2C。进行软琼脂克隆集落形成实验检测细胞的锚定非依赖生长能力，结果显示，过表达RGS13的HCT116和SW480细胞，其细胞克隆集落的形成能力显著低于对照空载细胞（P＜0.01），见图2D、图2E。细胞迁移侵袭实验结果显示，过表达RGS13的HCT116和SW480细胞，其迁移与侵袭能力显著低于对照空载细胞（P＜0.01），见图2F、图2G。

2.3 RGS13可下调β-catenin的表达从而影响相关转录因子的表达，进而抑制CRC细胞系的增殖、迁移与侵袭 Westernblot结果表明，在过表达RGS13的HCT116和SW480细胞中，β-catenin的表达量低于对照空载细胞，见图3A。使用蛋白酶体阻断剂MG132预处理过表达RGS13的HCT116细胞和对照空载细胞后，再使用蛋白合成抑制剂CHX处理不同的时间。结果发现，过表达RGS13的HCT116细胞的β-catenin的降解速率高于对照空载细胞，见图3B。

图1 RGS13在CRC组织与细胞系中表达降低且与CRC患者分期和无病生存期相关

图2 RGS13的下调可显著促进CRC细胞的增殖、迁移与侵袭

RT-qPCR结果表明，在过表达RGS13的HCT116细胞中，CCND1、c-Myc和MMP7的mRNA水平较对照空载细胞均发生了显著下调（P＜0.01），见图3C。为了进一步验证，本研究在过表达RGS13的HCT116细胞中回转了β-catenin的表达，见图3D。再次进行RTqPCR发现，相较仅过表达RGS13的HCT116细胞，过表达β-catenin逆转了CCND1、c-Myc和MMP7的mRNA水平（P＜0.01），见图3E。在生物学功能方面，ATP实验、软琼脂克隆集落形成实验和细胞迁移侵袭实验共同表明，过表达β-catenin的HCT116-RGS13细胞，其增殖活力、集落形成能力和迁移与侵袭能力相较HCT116-RGS13对照空载细胞均得到了提高（P＜0.01），见图3F、图3G、图3H。

3 讨论

图3 RGS13下调β-catenin的表达以影响相关转录因子的表达而抑制CRC细胞系的增殖、迁移与侵袭

异常的Wnt/β-catenin信号在CRC等癌症研究中被大量报道，并且普遍认为这种异常的信号级联是CRC发生发展的关键因素[7]，90%的CRC患者都可以发现该通路的突变[8]。胞质中的β-catenin通常需要Wnt信号的激活，包括磷酸化、泛素化等一系列过程，导致β-catenin破坏复合物解聚，抑制β-catenin降解[9]，导致其在核内积累，并促进许多癌基因如c-Myc、MMP7和CCND1的转录[10-11]。近年来，有研究发现了调节β-catenin稳定性的不依赖Wnt的机制，如在人CRC中发现APC和RNF43的功能丧失突变，以及CTNNB1和RSPO2/3的功能获得性突变等[12]。本研究发现RGS13在CRC中表达下调，增强了β-catenin的稳定性，这提示RGS13可能通过不依赖Wnt的途径调节β-catenin的表达，并且，本研究发现β-catenin的表达升高增加了癌基因c-Myc、MMP7和CCND1的转录活性，且促进了CRC细胞的增殖、迁移与侵袭，这可能是RGS13下调促进CRC恶性进展的重要分子机制。

RGS13是G蛋白信号（RGS）家族的调节因子，包含一个特征性的保守RGS结构域。研究表明axin2RGS域中的一个位点能阻止axin2 聚合体的形成，对该位点的点突变会导致axin2聚合体的形成，从而增强对β-catenin信号的抑制；同时该研究发现了一种短肽，其可通过促进聚合体的形成从而促进β-catenin的降解，抑制β-catenin下游基因的转录，进而抑制CRC细胞的增殖[13]。另外一项研究也发现了一种小分子KYA1797K，其可以结合axin的RGS结构域，诱导形成β-catenin破坏复合物，促进β-catenin降解，从而抑制结直肠癌细胞的增殖[14]。β-catenin的降解速率调控是Wnt/β-catenin信号通路的关键调控方式，本研究发现含RGS结构域的RGS13的过表达可促进β-catenin降解，从而影响下游相关因子的表达，这提示RGS13可能通过RGS结构域促进β-catenin的降解，具体的作用机制有待进一步的验证。

综上，本研究认为RGS13或通过直接结合或间接方式下调β-catenin的胞质稳定性，进而降低下游关键癌基因的转录活性，从而在CRC的进展中发挥抑癌作用，而RGS13的下调将导致CRC的恶性进展。随着研究的不断深入，RGS13有望作为分子靶点用于CRC的诊断与治疗。