跑台运动通过抑制WNK2表达改善糖尿病心肌病的心室重构

王婷，蔡雪黎，李海燕，黄周青，王永华

1.温州医科大学附属第一医院心内科，浙江 温州 325015；2.温州医科大学附属第一医院康复科，浙江 温州 325015；3.温州医科大学体育部，浙江 温州 325035

糖尿病导致的糖尿病心肌病（diabeticcardiomyopathy, DCM）是独立于高血压、冠心病的特异性心肌病，主要病理表现为心肌肥大、间质和血管外周纤维化及心肌细胞坏死，最终发展为充血性心力衰竭[1]。研究发现，运动疗法在一定程度上通过不同机制（如抗炎、减少凋亡或调控自噬水平）缓解慢性疾病如高血压、DCM以及某些肿瘤的进展[2-4]。有文献报道，运动干预可以降低心血管疾病的病死率[5]。美国糖尿病学会也倡导运动作为一种重要的非药物干预方式，用于改善糖尿病心脏病并发症。WNK激酶2（withnolysinekinases2, WNK2）是一种胞质丝氨酸-苏氨酸激酶[6]，主要表达于脑、心肌、小肠和结肠[7-8]，参与调控细胞增殖、肿瘤生长和侵袭[9]；WNK2表达的缺失也与延缓衰老有关[10]。本研究通过对db/db糖尿病小鼠进行10周的跑台运动干预，探讨WNK2在运动保护DCM中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物和细胞

1.1.1 实验动物：20只8周龄雄性db/db小鼠，20只C57BL/6小鼠购自南京模式动物研究所，于温州医科大学实验动物中心SPF级实验动物房分笼饲养。实验期间自由进食和饮水，所有小鼠统一饲养在12h:12h光-暗交替循环的恒定室温环境中。本研究采取的实验方案已由温州医科大学实验动物伦理委员会批准（wydw2016-0266），动物许可证号：SYXK（浙）2021-0017。

1.1.2 细胞：大鼠心肌细胞系H9C2购自上海生物化学和细胞生物学研究所。在37℃，5%CO2的细胞培养箱中使用低糖完全培养基（DMEM1g/L）（含10%胎牛血清和1%青、链酶素混合液）培养细胞。

1.2 主要设备与试剂 血糖仪（艾科）购自杭州艾康生物技术有限公司，ZS-PT小动物实验跑台购自北京众实迪创科技发展有限公司，高分辨率小动物超声影像系统（Vevo3100）购自加拿大FujifilmVisualSonics公司。GAPDH（#2881S）抗体购自美国CellSignalingTechnology公司，转化生长因子β（transforminggrowthfactor-β, TGF-β）（ER31210）、基质金属蛋白酶9（matrixmetalloproteinase9, MMP9）（ER1706-40）、肌球蛋白重链（myosinheavychain, MyHC）（ET1702-88）抗体购自杭州华安生物公司。I型重组人胶原蛋白（collagen-I, COL-I）（sc293182）和心房钠尿肽（atrialnatriureticpeptide, ANP）（sc-515701）均购自美国SantaCruzBiotechnology公司。WNK2（MBS252985）购自美国MyBioSource公司。葡萄糖和链脲佐菌素购自美国Sigma公司。WNK2激酶抑制剂（WNKkinaseinhibitor, WNK463）（HY-100626）购自美国MedChemExpress公司。

1.3 实验分组

1.3.1 动物分组：在实验进行前，所有小鼠均适应性喂养1周，db/db小鼠随机分成2组：db/db糖尿病组（db/db组），db/db糖尿病+运动组（db/db+EX组），每组10只。C57BL/6小鼠同样分2组，分别为空白对照组（WT组），单纯运动组（EX组）。

1.3.2 细胞分组：实验细胞分为4组，分别为：对照组（CTRL组）、高糖模型组（HG组）、WNK463和高糖处理组（HG+WNK463组）、WMK463处理组（WNK463组）。将H9C2细胞以每孔1×106个接种在六孔板或33mm培养皿中，WNK2抑制剂WNK463以1μmol/L的浓度预处理细胞1h，在高糖刺激H9C2细胞模型中，葡萄糖的浓度为33mmol/L，处理24h后收取样本用BCA法测定蛋白浓度并进行蛋白质印迹（Westernblot）实验或免疫荧光。

1.4 实验运动方案

1.4.1 运动方式：采用电动动物跑台，参考FERNANDO等[11]的研究，制定小鼠的运动强度和时间，跑台自动记录小鼠的运动速度、运动时间和距离。

1.4.2 运动计划：适应性训练1周：坡度0°，速度8m/min，持续时间20min，运动频率1次/d，5d/周。正式训练10周：db/db+EX组和EX组：动物跑台坡度0°，速度10m/min，持续时间60min，运动频率1次/d，5d/周。db/db组和WT组：将小鼠置于跑台的跑道上，但不开启跑台，跑道不转动。

1.5 超声心动图 小鼠处死前1d采用经胸二维超声心动图对其进行心功能测量。检测过程中异氟烷麻醉，除去心前区毛发，控制心率稳定在400～500次/min，使用高分辨率小动物超声影像系统进行超声心动扫描术。采集M型和短轴图像，记录波形及相关数据。

1.6 动物取材 跑台末次运动训练结束后24h处死，取血清和心脏组织。取材前禁食不禁水12h。眼眶取血，分离血清，用于生化指标检测；取心肌组织，进行石蜡包埋和置于液氮中冻存。用于苏木素伊红染色（hematoxylin-eosinstaining, HE）、马松三色（Masson）染色、麦胚凝集素（wheatgermagglutinin, WGA）染色、Westernblot和实时荧光定量聚合酶链反应（real-timequantitativepolymerasechainreaction, RT-qPCR）检测。

1.7 HE染色、Masson染色和WGA-AF488染色 将石蜡切片置于60℃的烘箱里烘片2h，二甲苯脱蜡，经由高到低浓度乙醇脱水。依次用苏木素染液、伊红染液对组织进行HE染色，按照Masson染色液依次用Weigert铁苏木素染色液、丽春红品红和苯胺蓝染色，以及用WGA染液避光染色，封片后在显微镜下观察、拍照。Masson染色分析为计算胶原容积分数，即胶原阳性的蓝色面积百分比。

1.8 罗丹明标记的鬼笔环肽染色 将适量H9C2细胞均匀地接种于荧光小皿中，经WNK463和葡萄糖处理后，弃去培养皿中细胞培养基，PBS漂洗，用4%的多聚甲醛固定10min，0.5%TritonX-100透化处理5min，用80～200nmol/L的TRITC标记鬼笔环肽工作液室温避光孵育30min，细胞在PBS中洗涤3次后，使用DAPI溶液对细胞核进行复染，然后用抗荧光淬灭剂封片并在荧光显微镜下进行荧光观察。

1.9 免疫组化 石蜡切片脱蜡后加0.01mol/L枸橼酸钠缓冲液（pH=6.0），放入高压锅加热至95℃，加压加热2min（从冒气开始计时），压力降至0后取出，自然冷却后PBS漂洗，使用3%双氧水（用80%甲醇稀释）阻断，室温静置10min，用PBS洗3次，滴加适量一抗（WNK2，1:100稀释），室温孵育60min，弃去一抗，漂洗后滴加适量二抗（1:100稀释），室温孵育60min，弃去漂洗，加入新鲜配置的DAB显色液（在显微镜下观察，根据染色程度选择适当时间），最后脱水封片。

1.10 Westernblot检测 用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂）分别提取心肌组织蛋白样本和H9C2细胞蛋白样本。对样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳转移到PVDF膜上。用5%的脱脂奶粉与膜在室温缓慢摇荡1～2h孵育，进行膜封闭，然后TBST洗涤。用1%的BSA稀释的抗体孵育，4℃冰箱过夜。TBST洗涤后二抗室温孵育2h。随后ECL显影、曝光。ImageJ11.0软件进行条带灰度值分析。以GAPDH为内参计算蛋白的相对表达量。

1.11 动物组织总RNA的提取与RT-qPCR 剪碎动物组织，然后使用TRIzol、氯仿抽提RNA，再经过异丙醇沉淀，无水乙醇洗涤，晾干，最后视沉淀量加入10～20μLDEPC水溶解RNA。测定RNA的浓度和纯度。配制反转录体系和RT-qPCR反应体系，引物由上海生工生物工程有限公司合成，COL-I上游引物：5’-TGGCCTTGGAGGAAACTTTG-3’，下游引物：5’-CTTGGAAACCTTGTGGACCAG-3’；TGF-β上游引物：5’-TGACGTCACTGGAGTTGTACGG-3’，下游引物：5’-GGTTCATGTCATGGATGGTGC-3’；β-actin上游引物：5’-TGGCCTTGGAGGAAACTTTG-3’，下游引物：5’-CTTGGAAACCTTGTGGACCAG- 3’；MyHC上游引物：5’-CAAAGGCAAGGCAAAGAAAG-3’，下游引物：5’-TCACCCCTGGAGACTTTGTC-3’；ANP上游引物：5’-AAGAACCTGCTAGACCACCTGGAG-3’，下游引物：5’-TGCTTCCTCAGTCTGCTCACTCAG-3’；MMP9上游引物：5’-GCAGAGGCATACTTGTACCG-3’，下游引物：5’-TGATGTTATGATGGTCCCACTTG-3’。用2-ΔΔCT法计算上述RNA的相对表达量。

1.12 统计学处理方法 采用SPSS22.0统计软件进行数据分析。计量资料用±s表示，多组间比较采用双因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 10周跑台运动改善小鼠心脏功能障碍 与WT组相比，db/db组小鼠心肌增厚，心脏质量/体质量比降低，左心室缩短分数降低，而db/db+EX组的射血分数和左心室缩短分数及心脏质量/体质量高于db/db组，差异有统计学意义（P＜0.05）。与WT组相比，db/db组血糖明显升高，db/db+EX组血糖较db/db组下降，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。这表明糖尿病小鼠心脏收缩能力明显下降，而运动减轻了糖尿病小鼠心肌肥厚，改善了心脏功能紊乱，并且主要不是通过改善血糖实现的。

图1 4组小鼠的心超、血糖、心脏质量/体质量、射血分数、左心室缩短分数比较

图2 小鼠心肌组织免疫组化结果

图3 小鼠心肌肥大和纤维化相关的蛋白和mRNA的表达

2.2 跑台运动缓解小鼠心脏纤维化、肥大 心脏HE染色结果显示，与WT组相比，db/db组小鼠心肌组织肌纤维排列显著紊乱，EX组心肌组织无显著变化，而db/db+EX组小鼠这一现象得到显著改善。Masson染色结果显示，db/db组小鼠心肌表现出明显的胶原组织和纤维组织的沉积，而db/db+EX组小鼠纤维化堆积的情况得到明显改善，差异有统计学意义（P＜0.05）。心肌组织WGA染色结果显示，与db/db组相比，db/db+EX组小鼠的心肌细胞肥大得到了改善，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。Westernblot检测结果发现，与WT组相比，db/db组小鼠心肌组织中心肌肥大指标（ANP和MyHC）和纤维化指标（TGF-β、COL-I和MMP9）表达量显著升高；而与db/db组相比，db/db+EX组这些蛋白表达量显著减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；见图3A-F。RT-qPCR检测结果发现，与WT组相比，db/db组小鼠心肌组织中心肌肥大指标（ANP和MyHC）和纤维化指标（TGF-β、COL-I和MMP9）mRNA表达量显著上升；而与db/db组相比，db/db+EX组以上蛋白的mRNA水平显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；见图3GK。

2.3 跑台运动显著抑制了心脏组织WNK2 的表达心脏免疫组化结果表明，与WT组相比，EX组心肌组织的WNK2表达差异无统计学意义（P＞0.05），db/db组小鼠心肌组织的WNK2表达显著增加，而经10周运动后心肌组织的WNK2表达量显著下调，差异有统计学意义（P＜0.05）；心肌组织的Westernblot和RT-qPCR检测结果表明，WNK2蛋白和mRNA的相对表达量亦发现同样的趋势，差异有统计学意义（P＜0.05），提示运动干预显著抑制了心肌WNK2的表达。见图4。

2.4 抑制WNK2可以缓解高糖诱导的H9C2肥大和纤维化 为进一步验证WNK2对高糖诱导的心肌纤维化和肥大的影响，我们利用WNK463预处理H9C2心肌细胞系。WNK2表达在高糖刺激的H9C2细胞中以时间依赖性方式增加，6h组的细胞与CTRL组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），并在24h趋于平稳，见图5A，所以我们选择24h作为刺激时间来进行接下来的实验。用不同浓度的WNK463预处理细胞，细胞活力无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05），见图5D。WNK463抑制WNK2的效率随浓度的上升而增加，呈浓度依赖性，与CRTL组相比，5μmol/L组细胞WNK2表达降低明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图5B，且不影响细胞活力，所以我们选择5μmol/L的作为处理浓度进行实验。在H9C2细胞系中，我们发现与CTRL组相比，HG组的细胞WNK2表达明显上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。与HG组相比，HG+WNK463组的细胞WNK2表达减少，差异有统计学意义（P＜0.05），见图5C。

图4 小鼠心脏组织的WNK2免疫组化、蛋白和mRNA相对表达量

罗丹明标记的鬼笔环肽染色结果表明，WNK463预处理明显减轻了高糖诱导的H9C2细胞肥大，与CTRL组相比，HG组细胞体积相对值增加，HG+WNK463组的细胞较HG组体积相对值减小，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图6A、图6B。Westernblot检测结果表明，与CTRL组相比，HG组的细胞中心肌肥大指标（MyHC和ANP）和纤维化指标（MMP9、COL-I和TGF-β）表达显著上调，而HG+WNK463组的细胞较HG组表达下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图6C-I。因此，我们认为抑制WNK2可以缓解高糖诱导的H9C2细胞系肥大和纤维化。

3 讨论

图5 高糖刺激下和使用WNK2抑制剂WNK463处理下的H9C2细胞系WNK2的蛋白表达量

图6 WNK463预处理后高糖刺激下H9C2细胞的免疫荧光染色和肥大、纤维化指标的表达

糖尿病是一种严重威胁人类健康的慢性代谢性疾病，可因细胞外基质胶原分泌和降解失调，导致胶原过度沉积，心肌成纤维细胞增殖，室壁僵硬和顺应性下降等，导致左心室重构甚至收缩功能障碍[12-13]，其涉及的病理生理机制复杂繁多，如心脏脂毒性、高血糖等导致心肌细胞代谢紊乱；TGF-β作为介导纤维化相关信号通路的重要因子，可促进I型胶原和III型胶原蛋白的表达，构成了心肌纤维化的主要病理基础，在DCM心肌纤维化中扮演重要角色[14-15]；此外，MMP调控细胞外基质的合成和降解。据报道，糖尿病大鼠心肌中MMP2/MMP9和COL-I的表达量明显增加，促进心脏胶原过剩，导致心肌基质胶原沉积和功能障碍明显[16]。同样地，我们发现，与空白对照组相比，db/db小鼠心脏组织TGF-β、MMP9及COL-I明显增加，且HE和Masson染色显示心肌纤维排列显著紊乱，蓝色纤维组织明显，这些均提示db/db小鼠心脏纤维化。因此预防心肌纤维化、缓解心脏重构所致的心功能障碍一直是学者们研究的一个挑战。

研究表明，慢性规律的运动训练（每周300min的跑台）能平衡肥胖大鼠的肾素血管紧张素系统，减少炎症因子和骨骼肌的AT1受体的表达[17]，降低由于高龄造成的心肌细胞纤维化和糖基化终产物的堆积[18]，且运动训练可通过增加胰岛素敏感性，改善机体心肌代谢，维持细胞内线粒体功能等机制，改善心肌纤维化[19]。LEW等[20]研究指出运动训练改善了糖尿病小鼠冠状动脉功能障碍，缓解心功能障碍，尤其在心功能不全早期中高强度的运动获益多，且这获益与上调miR126有关，而独立于降血糖的作用。另外，指南指出糖尿病患者建议每周进行不少于150min的中等至高强度训练，频率至少为每周3d[21]，可见，运动训练是干预2型糖尿病及其并发症的有效防治措施。本研究发现，db/db小鼠经过10周的跑台运动，有效抑制了糖尿病导致的心脏纤维化蛋白TGF-β、MMP9及COL-I的表达，改善了心肌排列紊乱，减少心脏的纤维组织，这些研究结果提示对于2型糖尿病患者而言，规律的有氧运动能有效缓解心肌纤维化，改善心室的重构。

WNK2是一种胞质丝氨酸-苏氨酸激酶，属于蛋白激酶超家族成员。WNK在细胞周期调控、抗凋亡及肿瘤的侵袭与转移中扮演重要角色[22]。已经明确的是，在神经胶质瘤、脑膜瘤和胰管腺癌等肿瘤中WNK2表达显著下调[6，23-25]，WNK2的失活与肿瘤的早期复发相关；此外，WNK2作为氯离子共转运蛋白的调节因子，调节哺乳动物大脑细胞体积[8]。然而，WNK2在DCM中的表达情况以及所扮演的作用鲜见报道。在本研究中，我们利用db/db糖尿病小鼠及高糖刺激的H9C2细胞模型，观察到在高糖状态下的心肌细胞与小鼠心肌组织中WNK2的表达显著增加，且WNK2抑制剂处理有效减少TGF-β、MMP9及COL-I表达，同时抑制了心肌的肥大，提示在DCM中，WNK2上调与心脏的肥大、纤维化相关。值得注意的是，我们在糖尿病小鼠中发现，规律运动训练明显减少WNK2的表达，这佐证了运动干预改善DCM的部分机制，至少一部分是通过调控心肌WNK2表达有关。

综上所述，规律运动训练通过抑制心肌WNK2的表达来缓解心肌肥大及纤维化，进而抑制心室重构发挥其保护作用。