肢体缺血预/后适应改善脓毒症小鼠心肌IL-6及心脏功能的作用

陈海丽，龚佳红，李旭卿，李盛村

温州医科大学附属第二医院康复医学中心，浙江 温州 325027

脓毒症是导致死亡的常见原因，其发病率不断上升[1-2]。急性炎症反应是脓毒症患者的一个重要特征[3]。脓毒症患者会出现心肌损伤和心肌炎症，甚至50%脓毒症患者出现心功能不全[4-5]。脓毒症引起的心肌损伤出现过度的炎症反应、氧化应激、自噬障碍和细胞凋亡，也是其他多器官衰竭的重要环节[5-6]。由于促炎症消退策略，可以对全身性和心脏炎症实现双重调控，因而抗炎成为非常重要的脓毒症治疗策略。不同于药理学方法，肢体远端缺血预适应（remoteischemicpreconditioning, RIC）被认为是一种低成本、低风险、不良反应较小的康复手段[7]。RIC有对抗氧化应激、炎症和抵御心脏损伤的作用[8]。已有研究表明，RIC对多种心脏疾病都有效果，也有研究指出，肢体远端缺血后适应（postremoteischemicconditioning, pRIC）也有效果[9]。然而，在脓毒症心脏损伤中RIC或pRIC最佳的时间组合以及保护作用机制仍不清楚。白细胞介素6（interleukin-6, IL-6）是一种多效细胞因子，在急性炎症反应过程中起关键作用[10]。血液IL-6含量可以作为早期脓毒症发病指标，在心肌炎、梗死后心脏炎症和脓毒症心肌病中IL-6往往表达增加[11]。IL-6 的增加可以作为脓毒症预后及炎症严重程度的依据[12]。基于IL-6 的变化，判断不同强度或不同组合的RIC效果的研究仍不多。因此，本研究旨在确定肢体缺血预、后处理对脓毒症心脏损伤的影响，探讨不同组合的预适应和后适应通过IL-6而改善脓毒症心脏功能降低的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物：8周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠由温州医科大学实验动物中心提供，饲养于温州医科大学SPF级实验动物中心，室温维持在21～23℃，湿度40%～60%，12h/12h自然光交替照明，自由饮水饮食。

1.1.2 试剂与仪器：脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）购自德国Sigma-Aldrich公司；TRIzol、反转录和qRT-PCR购自大连Takara公司。Vevo2100小动物超声仪购自加拿大VisualSonics公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组：实验1：对照组；LPS组，腹腔注射6mg/kgLPS；单侧腿缺血预适应组，在注射LPS之前进行单侧后肢大腿根缺血预适应方案干预；双侧腿缺血预适应组，在注射LPS之前进行双侧腿同时缺血预适应干预；单侧腿缺血后适应组，注射LPS之后即刻进行单侧腿缺血适应干预；双侧腿缺血后适应组，注射LPS之后即刻进行双侧腿同时缺血适应干预。每组6只小鼠。

实验2：对照组、LPS组、缺血预适应组、间隔2h的2次缺血后适应组、缺血预适应叠加缺血后适应组。每组6只小鼠。

实验3：对照组、LPS组、缺血预适应组。每组6只小鼠。

1.2.2 小鼠干预过程：缺血预适应和后适应均为对小鼠大腿根部用橡皮筋结扎3圈缺血5min，松开10min，重复4次为一个干预程序。其中缺血预适应1h后注射LPS，缺血后适应为注射LPS后即刻进行。

1.2.3 小鼠心脏功能评价：应用Vevo2100小动物超声成像仪评价小鼠心脏功能。1%异氟烷吸入麻醉小鼠后，仰卧位固定于检测台，左侧卧位安置超声探头，以乳头肌水平作为心脏二维短轴观察标志，同时记录M-model扫描，测量3个心动周期左心室舒张末期内径（leftventricularenddiastolicdiameter, LVEDd）和左心室收缩末期内径（leftventricularendsystolicdiameter, LVEDs），据此计算获取左心室射血分数（ejectionfraction, EF）和短轴缩短率（fractionshortening, FS）。以EF和FS来评价心脏收缩功能。

调整探头对准心尖，获取心尖四腔观，多普勒模式测量二尖瓣流出道上方血流速度，以舒张期最大早期速率（E波）和最大末期速率（A波）比值，作为评价舒张功能的指标。

1.2.4 心肌组织mRNA表达检测：提取总RNA，取15mg心肌组织于EP管中，加入1mLTRIzol，匀浆，加入200μL氯仿，4℃、12000×g离心15min，吸取上清液至新的1.5mLEP管。加入等体积的异丙醇，4℃、12000×g离心10min，乙醇清洗，离心后加入DEPC水30μL溶解。分光光度计测定260nm和280nm下的吸光度值。以A260/A280评价提取纯度和浓度。

按反转录试剂盒说明方法将RNA反转录为cDNA，并按表1引物扩增对应基因，定量分析目的基因相对GAPDH的表达量。

1.3 统计学处理方法 采用GraphPad9软件进行数据分析。计量资料用±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 目的基因引物序列

2 结果

2.1 单、双侧腿缺血预/后适应对心肌IL-6mRNA表达的影响 前期我们对小鼠后肢单侧腿，采用3次每次10min或4次每次5min，间隔时间10min，开展不同干预时间组合的缺血预适应，结果表明，4次每次5min的干预方式比前者更能降低LPS小鼠的病死率，因此，实验中都采用4次每次5min的肢体缺血适应干预。

与对照组比，LPS组小鼠心肌IL-6mRNA的相对表达量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与LPS组比，单侧腿缺血预适应和单侧腿缺血后适应（LPS注射后即可开展）组小鼠心肌IL-6mRNA的相对表达量显著降低（P＜0.05）；与对应的单侧腿缺血预/后适应组比，双侧腿缺血预/后适应组小鼠心肌IL-6mRNA的相对表达量增加（P＜0.05）。见图1。

图1 单侧或双侧缺血预适应或后适应对脓毒症小鼠心肌IL-6mRNA的影响

2.2 不同组合的缺血预/后适应对心肌IL-6mRNA表达的影响 由于单侧腿干预降低IL-6mRNA的效果明显优于双侧腿同时干预，后续实验组别均为单侧腿缺血预适应或后适应干预。与对照组比，LPS组小鼠心肌IL-6mRNA的相对表达量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与LPS组比，单次缺血预适应组小鼠心肌IL-6mRNA的相对表达量显著降低（P＜0.05）；与LPS组和单次缺血预适应组比，缺血预适应叠加缺血后适应组小鼠心肌IL-6mRNA的相对表达量显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与LPS组比较，间隔2h的2 次缺血后适应组小鼠心肌IL-6mRNA的相对表达量显著增加（P＜0.05）。见图2。

图2 缺血预适应和后适应叠加干预对脓毒症小鼠心肌IL-6mRNA的影响

2.3 缺血预适应对心肌组织TNF-α、IL-1β、Atrogin-1和ApelinmRNA的影响 与对照组比，LPS组小鼠心肌中TNF-α、IL-1β和Atrogin-1 相对表达量增加（P＜0.05），而ApelinmRNA相对表达量降低（P＜0.05）。与LPS组相比，缺血预适应组小鼠心肌TNF-α和IL-1β的mRNA相对表达量显著降低（P＜0.05），见图3A、图3B。然而，缺血预适应组和LPS组Atrogin-1和Aplein相对表达量差异无统计学意义（P＞0.05），见图3C、图3D。

2.4 缺血预适应改善脓毒症小鼠心脏功能 与对照组比，LPS组小鼠收缩功能指标EF和FS显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与LPS组比较，缺血预实验组小鼠EF和FS显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4A-C。

与对照组比，LPS组小鼠舒张功能指标E/A比值显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与LPS组比，缺血预实验组小鼠E/A比值显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4D、图4E。

3 讨论

实验动物采用腹腔注射LPS并诱导脓毒症样病变，是脓毒症研究的经典模型。LPS导致小鼠表现出体质量减少，系统性炎症增加，心肌萎缩，甚至在短期内发生死亡[13]。心脏功能降低并引发其余多器官衰竭是脓毒症患者死亡的主要原因[14]。有研究指出，脓毒症心脏中存在过度的氧化应激、炎症和线粒体损害，而采用过表达Parkin分子可以通过改善线粒体质量和数量而阻止脓毒症所致的心肌萎缩[15]和心脏功能紊乱[16]。

图3 缺血预适应对脓毒症小鼠心肌TNF-α、IL-1β、Atrogin-1和ApelinmRNA相对表达量的影响

图4 缺血预适应对脓毒症小鼠心脏功能的影响

脓毒症心肌中出现严重的炎症反应，因此，促炎症消退是重要的治疗策略。有研究表明，与对照组比，LPS组小鼠的左室EF、FS、左室收缩压和左室内压变化速率较低，而IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子增加，同时心肌损伤标志物cTnT明显上调；而降低IL-6表达后，心肌细胞凋亡减少，心脏功能改善[17]。类似的研究指出，在LPS刺激的H9C2细胞培养液上清液中可以检测到IL-6 增加[5]。另外，IL-6直接上调其余促炎因子参与炎症应答，有助于LPS处理的心肌细胞凋亡[18]。在心脏主动脉狭窄小鼠心衰模型中，IL-6可以激活STAT3信号通路，进一步加剧氧化应激和炎症反应，类似的体外研究也表明IL-6刺激引起H9C2细胞氧化应激和有丝分裂吞噬相关蛋白增加而促进心肌细胞凋亡[19]。最近，还有研究更进一步证实IL-6并不是炎症反应的伴随现象，而是可以作为结局预后指标，研究人员建立了心房颤动小鼠模型，结果表明，与野生型小鼠相比，IL-6基因敲除小鼠缓解了心房颤动的发生在机制方面，研究者证实IL-6通过pSTAT3/STAT3信号通路诱导心房的早期纤维化，并参与术后心房颤动发生过程[20]。有研究还证明术后心房颤动患者心包引流液中的IL-6浓度较高，指出心包引流液中的IL-6可能成为临床预测术后心房颤动的生物标志物[21]。反之，IL-6基因敲除增加心肌中M2巨噬细胞分化，减少M1巨噬细胞分化并防止心肌细胞凋亡，最终减缓衰老小鼠的心功能不全[22-23]。由此可知，IL-6在LPS诱导的脓毒症心脏炎症过程中起重要作用，IL-6可以作为评价心肌炎症严重程度和预后情况的指标。在本研究中，LPS引起小鼠心肌中IL-6mRNA的表达增加，而且对缺血预适应或后适应非常敏感。本研究结果表明，依据心肌中IL-6mRNA的变化，可以更好地研究缺血预适应和后适应治疗组合、强度和叠加效益。

缺血预适应和后适应作为无创的物理治疗方式，可以用于抵御心梗、脓毒症心肌病的发生[24]，也可以减缓缺血性脑卒中的症状[25]。尽管缺血后适应也有保护作用[26]，早期的研究认为肢体缺血预适应可能优于缺血后适应，然而，缺血预适应是在健康动物中进行的，不太符合发病后治疗康复的干预需求，限制了其临床应用。因此，缺血预适应的保护作用分子机制尤其值得研究，模拟缺血预适应的药理学手段，可能会突破其临床应用限制。基于IL-6mRNA在心肌中的变化，本研究结果表明过多的肢体缺血适应干预并不是有利的，例如2h间隔的重复缺血后适应加剧了炎症反应，同样，双侧同时缺血预适应或后适应均未能进一步减轻炎症应答。本研究还发现，由于LPS仍未在小鼠体内发挥充分作用，即刻的缺血后适应很可能和缺血预适应有相同的机制，因此，我们也观察到缺血预适应和即刻缺血后适应的组合降低炎症的效果是最好的。

最后，本研究也证实了肢体缺血预适应改善脓毒症小鼠心脏功能，这与肢体缺血预适应降低心肌组织促炎因子IL-1β和TNF-α密切相关。脓毒症小鼠心脏中萎缩基因Atrogin-1 表达增加，Apelin基因的表达下降，然而，缺血预适应无法逆转两者的改变。这表明，缺血预适应组合其他抗萎缩策略，可能会发挥更大的保护脓毒症心肌的作用，具体机制仍需要进一步研究。在未来，应用生物医学或药理学方法模拟肢体缺血预适应的保护效益，以及发挥更稳定地保护效果，运用于更多病种[27]。

综上所述，在脓毒症小鼠中，缺血预适应通过降低促炎因子而改善其心脏功能。我们发现即刻的肢体缺血后适应和缺血预适应发挥抗炎效益，而叠加的缺血后适应却不利于脓毒症的炎症消退。此外，预适应和即刻后适应叠加能够有更多的保护效益。IL-6mRNA可以作为评价缺血预适应或后适应的各种组合效果好坏的敏感指标。