正交试验优选超声辅助提取南方红豆杉醇提药渣中多糖的工艺*

李碧渊 章可沁 谢缤瑶

浙江中医药大学附属第一医院 浙江 杭州 310006

红豆杉是世界公认的濒危天然珍稀抗癌药用植物，是提取抗癌有效化合物紫杉醇及其前体的重要来源[1]。提取得到的紫杉醇是一种抗癌活性非常强的紫杉烷类化合物，临床广泛用于治疗乳腺癌、肺癌、卵巢癌、食管癌等[2]，市场需求量非常大，但在红豆杉中含量却非常低（0.02%～0.04%），因提取紫杉醇每年产生大量的南方红豆杉药渣，此药渣中可能蕴含的多种生物活性成分未能被充分利用而造成资源浪费，这一“资源库”亟待被开发。

迄今为止，全世界已确定了16种红豆杉属(Taxus)植物，中国共4种及1变种，占总储量50%以上，其中以南方红豆杉分布最为广泛[3]。南方红豆杉的活性成分主要包括以紫杉醇为代表的紫杉烷类化合物，以及黄酮和多糖[4-6]。目前，对其提取紫杉烷类后药渣中黄酮苷类成分的研究已有相关报道[6]，但有关多糖的研究尚未见报道。本实验在前期研究基础上，继续探索南方红豆杉醇提紫杉烷类化合物后药渣中多糖的含量及纯度，为其构建科学的利用模式提供基础研究，从而建立循环产业链，增添资源附加值。

1 仪器与试药

1.1 仪器：Ultra-spec2100紫外分光光度计，Amersham Biosciences；LXJ-lib型离心机，上海安亭科学仪器厂；KQ5200超声清洗器，昆山市超声波仪器有限公司。

1.2 药材与试剂：南方红豆杉（Taxus chinensis var.mairei）的带叶枝条采自宁波红豆杉种植基地，葡萄糖对照品（0120-9501，中国药品生物制品检定所）；试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 原料预处理：新鲜的南方红豆杉带叶枝条用剪刀剪成小段，室内自然阴干，粉碎机将其粉碎，测含水量为5.21%，药材粉末石油醚脱脂3次，甲醇提取紫杉烷类[4]，过滤甲醇，风干除甲醇，得供试品。

2.2 供试品溶液制备：取供试品1.0g，加30ml水，60W超声0.5h，提取液加活性炭脱色，过滤并定容至100ml，Sevag法除蛋白，浓缩，50ml定容，取1.0ml提取液加入到10ml塑料材质圆底连盖离心管，加4.0ml无水乙醇，冰箱醇沉24h，4000r·min-1离心5min，弃上清液，沉淀加2.0ml水，超声溶解，得供试品溶液[5,7]。

2.3 方法学考察：分述如下。

2.3.1 对照品溶液制备：精密称取干燥至恒重的葡萄糖对照品，加水溶解并定容，得浓度为0.996mg·ml-1的对照品溶液。

2.3.2 检测波长选择：精密吸取1.0ml对照品溶液置20ml具塞试管中，加1.0ml 5%苯酚和5.0ml浓硫酸，加塞摇匀室温放置1min，沸水浴15min，冰水浴3min，室温10min，随行试剂为空白对照，460～520nm波长范围内进行扫描，选择有最大吸收的490nm为检测波长。

2.3.3 标准曲线绘制：精密吸取对照品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml置试管中，每管加水补足1.0ml，按“2.3.2”项显色，首管作空白对照，以葡萄糖浓度X为横坐标，吸光值A为纵坐标，得到回归方程：y=0.9381x+0.0634(r=0.9996)，对照品在 99.6～996mg·L-1内与吸光值线性关系良好。

2.3.4 稳定性试验：精密吸取1.0ml供试品溶液，按“2.3.2”项显色，每0.5h测吸光值，连续6次测定结果的RSD为1.39%，表明供试品溶液150min内稳定。

2.3.5 精密度试验：从同一份供试品溶液中精密吸取6份，每份1.0ml，按“2.3.2”项显色，测吸光值并计算含量，得RSD为2.22%，表明该法精密度良好。

2.3.6 重复性试验：取6份1.0g的供试品，按照“2.2”项制备，“2.3.2”项显色，测吸光值并计算含量，得RSD为3.75%，表明该法重复性较好。

2.3.7 回收率试验：称取5份已知多糖含量的供试品，加等量对照品，提取，显色并进行含量测定，计算得到平均回收率为97.86%，RSD为1.18%。见表1。

表1 南方红豆杉药渣中多糖回收率试验测定结果（n=5）

2.4 单因素考察：分述如下。

2.4.1 料液比对多糖提取得率的影响：料液比共考察5个水平（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50），每个水平平行3份，每份1.0g供试品，60W超声10min，重复2次，醇沉浓度为80%。不同料液比多糖的提取得率分别为（2.63±0.05）%、（2.97±0.13）%、（3.41±0.08）%、（3.67±0.07）%、（3.87±0.07）%。结果显示，料液比越大，多糖的提取得率越高，说明增大料液比有利于加速质量传递，但过大的料液比会增加后期浓缩时间和能耗，鉴于料液比大于1∶30后多糖得率增加不明显，故选1∶30为其余因素考察项的料液比。

2.4.2 超声功率对多糖提取得率的影响：超声功率共考察5个水平（50、60、70、80、90W），每个水平平行3份，每份1.0g供试品，30倍量水，重复超声2次，每次10min，醇沉浓度为80%。不同超声功率多糖的提取得率分别为（2.47±0.13）%、（2.76±0.09）%、（2.69±0.04）%、（2.37±0.12）%、（1.95±0.04）%。结果显示，超声功率60W时多糖的提取得率最高，可达到（2.76±0.09）%，因此其余因素考察项的超声功率暂定为60W。

2.4.3 超声时间对多糖提取得率的影响：超声时间共考察5个水平（10、20、30、40、50min），每个水平平行3份，每份1.0g供试品，加30倍量水，60W超声2次，醇沉浓度为80%。不同超声时间多糖的提取得率分别为（1.95±0.06）%、（2.99±0.07）%、（3.44±0.09）%、（3.68±0.06）%、（3.72±0.11）%。结果显示，30min内，多糖提取得率随着超声时间增加而增加，但随着超声时间的延长，多糖得率增加不明显，因此其余因素考察项的超声时间定为30min。

2.4.4 超声次数对多糖提取得率的影响：超声次数共考察5个水平（1、2、3、4、5次），每个水平平行3份，每份1.0g供试品，加30倍量水，60W超声，每次30min，醇沉浓度为80%。不同超声次数多糖的提取得率分别为(2.65±0.08)%、(3.68±0.11)%、(3.84±0.07)%、(3.92±0.09)%、(4.04±0.08)%。结果显示，超声2次多糖得率较大，因此，正交实验中将超声次数定为2次。

2.4.5 醇沉浓度对多糖提取得率的影响：醇沉浓度共考察5个水平（50%、60%、70%、80%、90%），每个水平平行3份，每份1.0g供试品，加30倍量水，60W超声30min，重复超声2次。不同醇沉浓度多糖的提取得率分别为(3.11±0.07)%、(3.68±0.10)%、(3.91±0.09)%、(4.04±0.08)%、(3.70±0.13)%。结果显示，醇沉浓度80%时多糖的得率最高，因此，正交试验中将醇沉浓度定为80%。

2.5 正交试验：参考南方红豆杉醇提药渣中多糖提取工艺的单因素考察结果，采用正交试验进一步优选提取参数[8]。选择料液比、超声时间和超声功率为考察因素，每个因素设3个水平（表2），不考虑交互作用，进行L9(34)正交实验优选最佳提取工艺，每个水平平行3份，每份超声2次，醇沉浓度为80%，结果见表3。

表2 正交试验因素水平表

表3 正交试验表及结果

从表3可见，影响药渣中多糖提取得率的重要性顺序为A＞C＞B。南方红豆杉醇提药渣中多糖的最优工艺为A2B2C3，根据方差分析发现A项有显著影响（F=19.727，P＜0.05），B、C项则无显著影响，确定最佳提取工艺为A2B1C1，即料液比1∶30、超声时间20min、超声功率50W。

2.6 验证试验与对比试验：为验证正交试验结果的可靠性，称取30g南方红豆杉醇提药渣，平行3份，按上述实验得到的最佳提取工艺进行提取和测定含量，测得多糖得率为3.73%，表明该法为南方红豆杉醇提药渣中多糖的最佳提取工艺，得率高且重现性良好。提取液浓缩、醇沉、烘干得多糖粗提物，计算纯度为89.53%，结果见表4。此外，称取30g南方红豆杉生药，平行3份，测得多糖的得率为5.12%。合并生药提取液并按上述方式得到多糖粗提物，计算纯度为70.53%，结果见表4。

表4 南方红豆杉药渣和生药中多糖的得率（n=3）

3 讨论

我国是全球中药消耗量最大的国家，也是中药药渣产生最多的国家。当前，针对药渣已开展了一系列研究与应用，如制成畜禽饲料、有机肥料、食用菌类栽培基料、燃料以及造纸等，但此类二次利用附加值较低[9]。

多糖含有大量羟基而具高亲水性[10]，不溶于有机溶剂，南方红豆杉醇提紫杉烷类化合物后，药渣中可能蕴含大量多糖，课题组前期实验也已证实这一情况[5]。更为重要的是，研究表明南方红豆杉多糖具有抗肿瘤及减轻阿尔茨海默病小鼠神经毒性和认知功能障碍等多种生物活性[11-13]。从药渣中继续提取得到具有高附加值的多糖类成分，不仅是对南方红豆杉的资源利用与保护，也为同类药渣二次利用提供方法借鉴。

药用植物的药渣一般为细胞壁成分，而多糖广泛分布于细胞壁中[7,9]，提取多糖主要是破坏或降解细胞壁。超声波辅助提取可以改善质量传递，更好地破坏细胞壁，从而加速溶剂渗透作用，参考前期实验，本试验采用超声辅助提取[4,5]。

本试验优选得到的南方红豆杉醇提药渣中多糖最佳提取工艺为加30倍量水，50W超声20min。在优化工艺条件下，南方红豆杉醇提药渣经提取得到的多糖与生药中提取得到的多糖相比，得率从5.12%下降到3.73%，纯度从70.53%提高到89.53%。实验表明，南方红豆杉醇提药渣可再次提取多糖，具有较高的二次开发价值。