藤梨根活性成分熊果酸、齐墩果酸对人胃癌细胞SGC-7901增殖以及VEGF、HIF-1α表达影响的研究*

刘宏飞 何国浓王 杰 余伟方 史国军

浙江中医药大学附属宁波中医院 浙江 宁波 315010

我国胃癌发病率在恶性肿瘤中排第二位[1]。目前对胃癌机制研究和治疗方法不断深入，但治疗效果提高却不明显[2]。中医药治疗本病已经有深入研究[3]，藤梨根被证明有抗肿瘤等作用，在临床治疗消化道肿瘤有一定疗效[4,5]。本研究通过观察不同浓度的藤梨根提取物熊果酸（XGS）、齐墩果酸（QDGS）对人胃癌细胞SGC-7901增殖以及对血管内皮生长因子（VEGF）、缺氧诱导因子（HIF）-1α表达的影响，为开发藤梨根及其制剂用于防治胃癌提供理论基础和科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验药品：熊果酸（批号：19062710）、齐墩果酸（批号：20032706）购于成都曼思特生物科技公司。

1.2 实验细胞：人胃癌细胞SGC-7901，由浙江省中医药研究院提供，来源于中国科学院上海细胞库。

1.3 主要试剂仪器：LV-HIF-1α、LV-NC由吉玛制药技术公司（上海）合成；HIF-1α、VEGF、EF-1α引物购于生物工程（上海）公司；xCELLigence RTCA DP多功能实时无标记细胞分析仪，艾森生物（杭州）公司；Nanodrop2000核酸蛋白质定量仪，Thermo公司；WES全自动蛋白表达分析系统，Protein Simple公司。

1.4 方法：分述如下。

1.4.1 细胞培养及慢病毒感染：SGC-7901细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，置37℃、5% CO2培养箱中培养，取对数生长期的细胞用于实验。构建HIF-1α过表达慢病毒载体LV-HIF-1α（3×108TU/ml）及阴性对照LV-NC（3×108TU/ml），SGC-7901细胞按5×104个/ml，每孔500μl接种于24孔板中，培养24h后以最佳病毒感染复数（MOI=20）加入过表达慢病毒及阴性对照病毒感染SGC-7901细胞，并加入5μg/ml的Polybrene以增加感染效率，24h后更换完全培养基继续培养48h，倒置荧光显微镜观察荧光强度。

1.4.2 实验分组：空白对照组（CON组），慢病毒阴性对照组（LV-NC组），模型组（LV-HIF-1α组），熊果酸高浓度6.25μg/ml组（LV-HIF-1α+XGS6.25组）、中浓度3.125μg/ml组（LV-HIF-1α+XGS3.125组）、低浓度1.5625μg/ml组（LV-HIF-1α+XGS1.5625组），齐墩果酸高浓度25μg/ml组（LV-HIF-1α+QDGS25组）、中浓度12.5μg/ml组（LV-HIF-1α+QDGS12.5组）、低浓度6.25μg/ml组（LV-HIF-1α+QDGS6.25组）。共9组。

1.4.3 RTCA DP实时细胞分析系统检测藤梨根提取物对细胞增殖的影响：取对数生长期的细胞分组培养96h，记录CI值。

1.4.4 Real-time PCR检测各组细胞VEGF、HIF-1α mRNA表达：取对数生长期的细胞分组给药干预，培养48h，收集细胞并用Trizol法提取总RNA，按照试剂盒说明进行逆转录反应和Real-time PCR检测。引物序列见表1。逆转录反应条件：37℃ 15min，85℃ 5s，4℃保存。PCR反应条件：95℃，30s；95℃，5s，60℃，30s，40个循环；熔解曲线：95℃，15s，60℃，60s，95℃，15s。采用相对定量分析方法（2-∆∆Ct法）进行分析。

表1 引物序列

1.4.5 Western blot检测各组细胞VEGF、HIF-1α蛋白表达：取对数生长期的细胞分组给药干预，培养48h，收集细胞并用全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，测定蛋白浓度，按照WES全自动蛋白定量分析试剂盒的操作说明操作，用Compass软件进行峰面积的分析，蛋白相对表达水平用PA目标蛋白/PA内参蛋白比值表示。

2 结果

2.1 稳定转染细胞株的建立：加入过表达慢病毒LVHIF-1α及阴性对照病毒LV-NC感染的SGC-7901细胞，用1μg/ml嘌呤霉素连续筛选10d，置于倒置荧光显微镜下拍照（见图1），可见稳定转染细胞株构建成功。

图1 稳定转染细胞株的建立

2.2 实时细胞分析系统检测XGS、QDGS对细胞增殖的影响：由表2可见，与CON组比较，XGS6.25组、XGS3.125组、XGS1.5625组、QDGS25组的48h CI值均显著降低（P＜0.01）；与LV-NC组比较，6个给药组的CI值均显著降低（P＜0.01）；与LV-HIF-1α组比较，6个给药组的CI值均降低（P＜0.05，P＜0.01）。与CON组比较，XGS6.25组、XGS3.125组、XGS1.5625组、QDGS25组、QDGS6.25组的72hCI值均显著降低（P＜0.01）；与LV-NC组比较，6个给药组的CI值均降低（P＜0.05，P＜0.01）；与LV-HIF-1α组比较，XGS6.25组、XGS3.125组、XGS1.5625组、QDGS25组、QDGS6.25组的72h CI值均显著降低（P＜0.01）。

表2 XGS、QDGS对CI值的影响(±s,n=3)

表2 XGS、QDGS对CI值的影响(±s,n=3)

注：与CON组比较，**P＜0.01；与LV-NC组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与LV-HIF1α组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

组别CON LV-NC LV-HIF1α XGS6.25 XGS3.125 XGS1.5625 QDGS25 QDGS12.5 QDGS6.25 48hCI 2.145±0.088 2.214±0.074 2.181±0.095 0.719±0.072**##▲▲1.585±0.063**##▲▲1.825±0.062**##▲▲1.649±0.086**##▲▲2.019±0.076##▲2.030±0.068##▲72hCI 3.724±0.041 3.995±0.031 3.807±0.014 0.490±0.015**##▲▲2.006±0.020**##▲▲2.733±0.103**##▲2.294±0.069**##▲▲3.227±0.136#3.301±0.042**##▲▲96hCI 5.624±0.105 5.554±0.117 5.186±0.025 0.254±0.019**##▲▲2.189±0.031**##▲▲3.573±0.063**##▲▲2.806±0.127**##▲▲4.064±0.056**##▲▲4.850±0.056

2.3 XGS、QDGS对细胞HIF-1α、VEGF mRNA表达的影响：与CON组和LV-NC组比较，LV-HIF-1α组、XGS1.5625组、QDGS6.25组的HIF-1α mRNA表达升高（P＜0.05，P＜0.01）；与LV-HIF-1α组比较，XGS6.25组、XGS3.125组、XGS1.5625组、QDGS25组、QDGS12.5组的HIF-1αmRNA表达显著降低（P＜0.01）。与CON组和LVNC组比较，LV-HIF-1α组的VEGF mRNA表达显著升高（P＜0.01），6个给药组的VEGF mRNA表达均显著降低（P＜0.01）；与LV-HIF-1α组比较，6个给药组的VEGF mRNA表达均显著降低（P＜0.01）。具体见图2。

图2 XGS、QDGS对细胞VEGF、HIF-1αmRNA表达的影响

2.4 XGS、QDGS对细胞HIF-1α、VEGF蛋白表达的影响：与CON组和LV-NC组比较，XGS6.25组、XGS3.125组、QDGS25组的HIF-1α蛋白表达显著降低（P＜0.01）；LVHIF-1α组、XGS1.5625组、QDGS12.5组、QDGS6.25组的HIF-1α蛋白表达显著升高（P＜0.01）。与LV-HIF-1α组比较，XGS6.25组、XGS3.125组、XGS1.5625组、QDGS25组、QDGS12.5组的HIF-1α蛋白表达显著降低（P＜0.01）。与CON组和LV-NC组比较，XGS6.25组、QDGS25组的VEGF蛋白表达显著降低（P＜0.01）；LV-HIF-1α组、XGS3.125组、XGS1.5625组、QDGS6.25组的VEGF蛋白表达升高（P＜0.05，P＜0.01）；与LV-HIF-1α组比较，XGS6.25组、QDGS25组、QDGS12.5组的VEGF蛋白表达显著降低（P＜0.01）。具体见图3。

图3 XGS、QDGS对细胞VEGF、HIF-1α蛋白表达的影响

3 讨论

胃癌发病主要是通过转录因子调控众多靶基因表达或活性而实现的，其中一些关键的转录因子如HIF-lα等在慢性炎症、细胞微环境缺氧的情况下出现活性失调，在本病的进展中起到促进作用。HIF-1α过表达与胃癌组织病理学特征、细胞转移潜力显著相关，并可能预示着浸润和转移，也可能是胃癌患者预后不良的风险因素。VEGF是目前已知重要的血管生成促进因子，对与维持肿瘤生长、侵袭转移等密切相关。由于胃癌等肿瘤组织常处于缺氧状态，HIF-lα在基因水平上直接调控VEGF的表达。活化了的HIF-lα与VEGF基因的调控序列相结合，从而启动VEGF转录，因此肿瘤组织中HIF-lα、VEGF常常存在高表达状态，因此研究出能够抑制HIF-1α/VEGF表达的药物在胃癌的治疗中应该具有良好的前景。

本次研究发现，在空白对照组人胃癌细胞SGC-7901中HIF-1α、VEGF出现高表达，而不同浓度的藤梨根活性成分对HIF-1α、VEGF的表达呈抑制作用。藤梨根为猕猴桃科植物中华猕猴桃的根,是我国特有种属，近几年有学者对藤梨根抗肿瘤作用进行研究，发现对实验性大鼠胃癌的生长转移具有抑制作用[6-9]。本课题组在前期研究中已初步筛选出熊果酸、齐墩果酸这两种活性物质是藤梨根抗肿瘤作用的主要活性成分[10,11]，同时本次研究发现，不同浓度的熊果酸、齐墩果酸对细胞增殖、HIF-1αmRNA/VEGF和蛋白表达均有抑制作用，且似乎呈时效关系，并呈现出浓度递增效果，提示其内在的抗肿瘤可能机制是通过下调VEGF、HIF-1α表达而发挥作用的，而抗肿瘤的效果有可能取决于长时间、高浓度应用，需要在今后进一步研究。