胆石症患者血清胆汁酸谱的检测与分析

金素丽 武 艳 汪 冉 杨 利 闫国超 赵 帅

1.河北医科大学第一医院检验中心，河北石家庄 050000；2.河北医科大学第二医院检验科，河北石家庄 050000

胆石症是临床上常见的一种疾病，根据结石的发生部位可分为胆囊结石、胆总管结石和肝内胆管结石，其中胆囊结石和胆总管结石较为常见[1]。我国胆囊结石患病率为2.3%～6.5%[2]，个别地区的发病率较高，甚至可达24.0%[3]，且随着人口年龄的增长和人们生活水平的提高，其患病率呈上升趋势[4-7]。研究表明，很多因素可以促进胆石的形成，如：遗传因素、环境、性别、脂质代谢异常、胆囊功能、促核因子、生活习惯、其他疾病影响等[8]，这些危险因素可以通过影响胆汁代谢导致胆汁成分改变或影响胆囊功能而诱发胆囊结石[9-10]。虽然，目前对胆石症形成的大致危险因素已有所认识，但仍缺乏有效的策略以预防胆石的形成[11]。胆汁酸是胆结石发病的重要因子，人体血清中胆汁酸各亚组分的比例、含量的变化，与胆石症的发病及转归关系密切，临床上常用熊脱氧胆酸作为胆结石的治疗药物[2]。因此，胆汁酸谱的检测可能对胆石症的诊断及预防有一定的价值。以往由于技术的限制，临床上主要测定总胆汁酸的含量，不能定量检测血清中各胆汁酸代谢组分的含量。随着高效液相色谱串联质谱（high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技术的发展，胆汁酸代谢谱的检测在临床上的应用日渐成熟，利用其高灵敏性、高特异性、高通量的特点检测血清中胆汁酸亚组分的含量可为筛选胆石症转化标志物提供一种新思路。本研究通过对胆石症患者血清中胆汁酸谱的检测，探索其在胆石症的临床诊断及早期预防中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019 年9 月至2020 年6 月在河北医科大学第一医院（以下简称“我院”）确诊为胆囊结石或胆管结石的患者59 例作为研究对象。其中胆囊结石组48 例，其中男16 例，女32 例；年龄27～75 岁，平均（54.08±12.68）岁；胆管结石组11 例，其中男2 例，女9 例；年龄32～73 岁，平均（58.36±14.61）岁。纳入标准：①经超声、CT 或磁共振胆胰管成像诊断确诊为胆囊结石或胆管结石；②同意血清胆汁酸谱检测。排除标准：①有病毒性肝炎、酒精性肝病等肝脏损伤的病史；②有梗阻性肠道疾病。对照组来自同期我院体检中心经彩超确认无胆囊结石或胆管结石的健康体检者，共26 例，其中男10 例，女16 例；年龄32～76 岁，平均（48.35 ±11.33）岁。三组一般资料比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性。该研究经我院伦理委员会审批同意，所有受试者知晓并签署知情同意书。

1.2 仪器及试剂

Waters ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQD（美国，Waters 公司）；H1650R 台式高速冷冻离心机（中国，上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；G560E 涡旋混合器（美国，Scientific Industries 公司）；CV100-DNA-H 真空离心浓缩仪（中国，北京乾明基因技术有限公司）；色谱柱为Waters 公司UPLCBEH C18 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。

HPLC-MS 级甲醇、甲酸、乙腈购自美国Fisher Scientific 公司；释放剂及内标液购自杭州佰辰公司，所有实验用水均为蒸馏水。

1.3 样本的采集及预处理

样本采集：胆囊结石组（术前）、胆管结石组（术前）及对照组于清晨空腹采集静脉血5 ml 并以离心力1760 g 离心10 min，提取上清液保存于-80 ℃冰箱待测。

预处理：取100 μl 血清样本，加入300 μl 胆汁酸内标工作液，旋涡混合5 min，离心力13 813 g，4℃低温离心5 min，吸取上清液300 μl，低温浓缩2 h 至近干；用100 μl 的样本释放剂B 液复溶，旋涡混合5 min，离心力13 813 g，4℃低温离心5 min，取上清液80 μl于96 孔板中，采用LC-MS/MS 对胆汁酸进行分析。

1.4 UPLC-MS/MS 分析

采用线性梯度洗脱模式对胆汁酸进行色谱分离，流速为0.4 ml/min，柱温为45℃。流动相A：10%（体积比）的甲酸水溶液；流动相B：乙腈∶甲醇为3∶1 的混合溶剂。梯度分离条件为：0～0.5 min，38%B；0.5～1.9 min，38%B →48%B；1.9～6.7 min，48%B →64%B；6.7～8.7 min，64%B→83%B；8.7～10.7 min，83%B→95%B；10.7～11.3 min，95%B→38%B；11.3～12.0 min，38%B。进样量为5 μl。

质谱仪离子化方式：电喷雾离子源，负离子模式。采用多反应监测模式对胆汁酸谱进行定量检测。15 种胆汁酸亚组分分别为：胆酸（choleic acid，CA）、鹅脱氧胆酸（chenodesoxycholic acid，CDCA）、脱氧胆酸（deoxycholic acid，DCA）、石胆酸（lithocholic acid，LCA）、甘氨胆酸（glycocholic acid，GCA）、甘氨熊脱氧胆酸（glycoursodeoxycholic acid，GUDCA）、甘氨鹅脱氧胆酸（glycochenodeoxycholic acid，GCDCA）、甘氨脱氧胆酸（glycodeoxycholic acid，GDCA）、牛磺胆酸（taurocholic acid，TCA）、牛磺脱氧胆酸（taurodeoxycholicacid，TDCA）、牛磺熊脱氧胆酸（tauroursodeoxycholic acid，TUDCA）、牛磺鹅脱氧胆酸（taurochenodeoxycholic acid，TCDCA）、牛磺石胆酸（taurolithocholic acid，TLCA）、甘氨石胆酸（glycocholic acid，GLCA）、熊脱氧胆酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）。

1.5 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件对所得数据进行统计学分析，正态分布计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，偏态分布计量资料的描述以中位数（四分位数）[M（P25，P75）]表示，多组间比较采用独立样本的Kruskal Wallis 检验。计数资料采用例数表示，比较采用χ2检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

三组TLCA、GLCA 大部分数据小于检测限，故未进行比较统计。三组GCA、GUDCA、GCDCA、TCA、TUDCA、TCDCA 这6 种胆汁酸亚组分比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）；两两比较发现，胆囊结石组和胆管结石组中的GCA、GUDCA、TCA、TCDCA 及TUDCA显著高于对照组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01），但胆囊结石组与胆管结石组GCA、GUDCA、TCA、TCDCA 及TUDCA 比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）；胆囊结石组GCDCA 高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05），但胆管结石组与对照组、胆囊结石组与胆管结石组之间GCDCA 比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表1。

表1 三组胆汁酸谱比较[nmol/L，M（P25，P75）]

3 讨论

胆石症是临床上的一种多见病、常发病。多数患者并无明显症状，常于健康体检或其他疾病检查时发现。但是胆结石的存在会对胆囊或胆管的正常结构和功能产生影响，如占位性的影响胆囊排空功能、结石嵌顿引起的胆绞痛、结石反复摩擦胆囊壁诱发胆囊炎等[2]。目前胆石症的诊断和治疗已相对成熟，但术后易出现诸多远期并发症[12]。有研究表明，胆囊切除术后部分患者肠道的细菌降解功能出现紊乱，直肠癌的发病率明显提高[13-17]。除此以外，胆石症患者术后结石的复发率较高[18]。多项研究显示，胆总管结石患者经内镜逆行胆胰管成像术后的复发率为4%～24%[19]，胆囊结石术后的复发率高达20%[20-23]。因此，对胆石症形成的原因及预防的研究显得尤为重要。

胆汁酸是胆固醇的代谢产物，是由24 个碳原子组成的胆烷酸衍生物，占人体总胆汁含量的50%～70%[24-25]。胆汁酸成分的改变是胆囊结石形成的主要原因之一[26]。在非疾病状态下，血清中胆汁酸各亚型含量及比例基本恒定，其中CA 约占总胆汁酸的40%，CDCA 占40%，DCA 占18%，LCA 不足2%。在疾病状态下，受肝细胞功能和胆汁酸肝肠循环的影响，血清中胆汁酸各亚型的种类及含量可能发生改变，胆固醇不能维持微胶粒状态，逐渐形成结晶并析出，最终导致结石的形成。

本研究中笔者使用LC-MS/MS 法，对胆囊结石组、胆管结石组及对照组的血清胆汁酸谱进行检测，发现三组GCA、GUDCA、GCDCA、TCA、TUDCA、TCDCA这6 种胆汁酸亚组分比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）；两两比较发现，胆囊结石组和胆管结石组中的GCA、GUDCA、TCA、TCDCA 及TUDCA 显著高于对照组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01），但胆囊结石组与胆管结石组GCA、GUDCA、TCA、TCDCA 及TUDCA比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）；胆囊结石组GCDCA 高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05），但胆管结石组与对照组、胆囊结石组与胆管结石组之间GCDCA 比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。本研究与相关报道[27-28]的结果基本一致，提示了本研究结果的可靠性。从以上结果可以看出，无论是胆囊结石组还是胆管结石组，其与对照组的胆汁酸谱都存在差异。其共同的差异胆汁酸为GCA、GUDCA、TCA、TCDCA 及TUDCA，且波动趋势一致，均比对照组增高。即此5 项指标与结石本身的位置无关，而与体内有无结石有关。由此可以推断，GCA、GUDCA、TCA、TCDCA 及TUDCA 这5 种胆汁酸组分可能为胆石症诊断的标志性分子。另有研究表明[27]，胆汁酸各亚组分在胆石症发生前，即超声、CT 等结果正常时已有明显的改变。因此，胆汁酸亚组分的检测有望成为预测及诊断胆石症的新型指标。

值得注意的是，本研究中，有差异的胆汁酸亚组分均为结合胆汁酸。这些差异胆汁酸亚组分在血清中与胆汁中是否一致尚未可知。对于两者之间相互影响及转化的过程中的影响因素还需要继续研究。

综上所述，本研究通过对血清中胆汁酸谱的检测探讨了胆汁酸代谢亚组分与胆石症的关系，为胆石症早期诊断及预防寻找可能的标志物。