基于TLR4信号通路研究小檗碱对血管紧张素Ⅱ诱导ANA-1细胞炎性应答的影响

2022-06-20高德兴贾沛芝

康复学报 2022年2期

高德兴，贾沛芝，彭军，林炜

福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州 350122

炎性应答是一个错综复杂的生物过程，炎性应答的启动是应对不同刺激的反应［1-2］，是人体对微生物感染、免疫细胞浸润、化学刺激以及组织损伤最有效的保护机制之一［3］。持续的损伤或刺激会导致炎性应答的不可控制，从而诱导全身性炎症，并促进慢性炎症的发展，导致器官损伤［4］。模式识别受体Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）作为上游信号分子，与炎性应答以及相关疾病的发生发展过程高度相关［5］，TLR4的激活能够启动炎性应答靶基因的转录，产生炎性应答［6-7］。有研究表明，血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）具有明显的促炎效应，参与了炎性应答过程中的关键环节，它能够造成损伤相关分子模式（damage-associated molecular pattern，DAMPs）和新抗原形成，固有免疫细胞被DAMPs激活并诱发固有免疫应答，AngⅡ能够被其中的TLR4识别，并触发机体免疫系统防御反应［8-9］。小檗碱（berberine，BBR）又名黄连素，是从黄连中分离提取的一种天然生物碱，是黄连的主要药物活性物质，它由连接2个甲氧基的萘环和连接双醚基环的苯相接而成，拥有较大的疏水层，能通过与髓样分化蛋白-2（myeloid differentiation protein-2，MD-2）竞争性结合而阻断脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）/TLR4复合体的形成，抑制TLR4信号介导的炎性应答，是TLR4信号通路的天然阻断剂，常被用于治疗肠道感染、眼部感染、炎症性肠病等炎症性疾病。AngⅡ诱导的炎性应答可能是通过门户蛋白TLR4激活网络调控下游级联反应，其中包括核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的激活以及氧化应激损伤。因此，本课题组提出假说：BBR能够通过抑制TLR4信号通路的激活进而调控AngⅡ诱导的炎性应答。为了进一步探讨其相关的作用机制，本研究使用AngⅡ刺激巨噬细胞（ANA-1）诱导建立体外炎症模型，验证AngⅡ是否能够诱导TLR4及下游信号通路的转导，并基于TLR4信号通路分析BBR对AngⅡ诱导炎性应答的影响。

1 实验材料

1.1 主要药物和细胞株

小檗碱（上海源叶科技有限公司）；AngⅡ粉末（美国APExBIO生物科技有限公司）；ANA-1细胞株（北京北纳创联生物技术研究院）。

1.2 主要试剂

RPMI-1640（Roswell Park Memorial Institute-1640）培养基（美国Gibco公司）；澳洲胎牛血清（美国Gibco公司）；青霉素/链霉素混合液（美国Hyclone公司）；CCK-8细胞增殖与细胞毒性检测试剂盒（美国APExBIO生物科技有限公司）；RIPA裂解液、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（南京碧云天生物技术有限公司，规格5×）；Phosphatase抑制剂Cocktail I（美国Abcam公司）；PhosStop磷酸酶抑制剂（德国罗氏诊断有限公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）；快速凝胶制备试剂盒（上海雅酶生物科技有限公司）；TLR4抗体、JNK抗体、p38抗体、GAPDH抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；MyD88抗体、Phospho-NF-κBp65（Ser536）抗体、NF-κB p65抗体、Phospho-JNK抗体、Phospho-ERK1/2抗体、ERK1/2抗体、Phospho-p38抗体、p38抗体、IRF3抗体、Phospho-IRF3抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；TLR4抑制剂（TAK-242）（美国MedChemExpress公司）；二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液（北京索莱宝科技有限公司）；磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）（美国Hyclone公司）。

1.3 主要仪器

37℃CO2培养箱（美国Thermo Forma公司）；超净工作台（苏州净化设备公司）；倒置显微镜系统（德国Leica仪器有限公司）；电泳仪、电泳槽、小型转膜仪、化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司）；连续波长多功能酶标仪（奥地利TECAN公司）。

2 实验方法

2.1 细胞分组与培养

2.1.1 细胞分组 BBR粉末溶解于DMSO溶液中，配制成20 mmol/L母液，按需用无血清1640培养基稀释成浓度为1、5、10μmol/L的工作液，并避光分装放置于-20℃冰箱保存。AngⅡ粉末溶解于PBS溶液，配制成1 mmol/L母液，按需用无血清1640培养基稀释成浓度为1μmol/L的工作液，分装放置于-80℃冰箱保存。ANA-1细胞株培养于RPMI-1640完全培养基中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱内。将对数增长期的ANA-1细胞按照随机数字表法平均分为对照组、荧光抗体组、模型组、低剂量BBR组、中剂量BBR组、高剂量BBR组、抑制剂组。

2.1.2 细胞培养 ①对照组：皿中加入2.5μL的DMSO；②荧光抗体组：皿中加入2.5μL的DMSO；③模型组：皿中加入浓度为1μmol/L的AngⅡ工作液；④低剂量BBR组：皿中加入浓度为1μmol/L的BBR工作液；⑤中剂量BBR组：皿中加入浓度为5μmol/L的BBR工作液；⑥高剂量BBR组：皿中加入浓度为10μmol/L的BBR工作液；⑦抑制剂组：皿中加入浓度为10μmol/L的TAK242工作液。

2.2 观察指标

2.2.1 细胞增殖与毒性检测实验方法检测细胞活力取对数生长期ANA-1细胞以1×105个/mL的密度接种于96孔板培养24 h后，弃培养基，低、中、高剂量BBR组分别加入1、5、10μmol/L工作液100μL干预24 h后，弃培养基，加入CCK-8溶液培养2 h后，在450 nm波长下测吸光度（Absorbance，Abs）值（A值）。每个浓度至少做3个复孔。采用细胞增殖与毒性检测实验方法（cell counting kit-8，CCK-8）检测对照组，低、中、高剂量BBR组的细胞A值。

2.2.2 流式细胞术检测细胞膜上TLR4平均荧光强度取对数生长期ANA-1细胞按2.5×105个/mL的密度接种于35 mm培养皿中，待细胞生长至汇合度达60%～70%，弃原培养基，改用无血清1640培养基培养6 h后，模型组用1μmol/L AngⅡ刺激15 min；模型＋小檗碱高剂量组用高剂量BBR预处理2 h后，用1μmol/L AngⅡ刺激15 min，弃上清，用PBS溶液将细胞吹打下来，制备成单细胞悬液，离心后弃上清。荧光抗体组、模型组、模型＋小檗碱高剂量组均分别加入TLR4荧光抗体（预冷1×PBS配制）100μL，避光孵育15～30 min；之后于1 000 r/min离心机上离心3 min；最后用预冷PBS清洗细胞3次后，采用流式细胞术检测TLR4的平均荧光强度（The mean fluorescence intensity，MFI）。

2.2.3 ELISA法检测白细胞介素-1β、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α的含量取对数生长期ANA-1细胞以2.5×105个/mL的密度接种于60 mm培养皿中，弃原培养基，改用无血清1640培养基培养6 h后，模型组加入1μmol/L AngⅡ处理细胞24 h；模型＋低剂量BBR组、模型＋中剂量BBR组、模型＋高剂量BBR组、模型＋抑制剂组加入不同浓度BBR或TAK 242预处理2 h后，用1μmol/L AngⅡ处理细胞24 h，收集培养基上清液备用。分别按顺序加入标准品和各组样本，作复孔。加酶联亲和物并均匀振荡后置于37℃恒温中1 h，然后弃上清，清洗后加入底物，避光保存15 min。在各孔中加入反应终止液。采用ELISA法检测白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量。

2.2.4 实时定量PCR法检测IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的水平细胞培养及铺板操作如“2.2.3”项所述，模型组加入1μmol/L AngⅡ处理细胞6 h；模型＋低剂量BBR组、模型＋中剂量BBR组、模型＋高剂量BBR组分别加入1、5、10μmol/L BBR预处理2 h；模型＋抑制剂组加入10μmol/L TAK242抑制剂预处理2 h。各组分别用1μmol/L AngⅡ处理细胞6 h，用Trizol法提取RNA，遵照cDNA合成试剂盒进行逆转录并扩增，采用实时定量PCR法（quantitativereal-time PCR，Q-PCR）检测IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的水平。引物序列如表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2.2.5 Western blot法检测TLR4信号通路相关蛋白的表达模型组加入1μmol/L AngⅡ处理细胞15、30、45 min以及12 h；模型＋低剂量BBR组、模型＋中剂量BBR组、模型＋高剂量BBR组分别加入1、5、10μmol/L BBR预处理2 h；模型＋抑制剂组加入10μmol/L TAK242抑制剂预处理2 h。各组分别用1μmol/L AngⅡ刺激15、30、45 min以及12 h，收集细胞用于Western blot检测。将细胞用RIPA裂解液提取总蛋白，蛋白质定量法（bicinchoninic acid，BCA）测定蛋白浓度。各蛋白样品均加入1/4总蛋白体积的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）蛋白上样缓冲液，在100℃金属锅中变性5～10 min后，使用SDS-PAGE电泳法进行凝胶电泳，每个孔上样量30μL，电泳条件：80 V 30 min、100 V 75 min，电泳结束后将蛋白转移到0.22μm聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，转膜条件：100 V 90 min。转膜结束后，用5%脱脂奶粉封闭1～2 h后加入相应一抗4℃孵育过夜。采用辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5 000）常温孵育1～2 h后，用Bio-Rad凝胶成像系统进行图像分析。采用Western blot检测p-p65、p65、p-IRF3、IRF3、p-ERK、ERK、p-p38、p38、JNK、p-JNK、TLR4、MyD88、p-IκBα、IκBα、AP-1蛋白的表达。

2.2.6 生化法检测丙二醛含量和超氧化物歧化酶活力模型组加入1μmol/L AngⅡ处理细胞12 h；模型＋低剂量BBR组、模型＋中剂量BBR组、模型＋高剂量BBR组分别加入1、5、10μmol/L BBR预处理2 h。各组分别用1μmol/L AngⅡ刺激15、30、45 min以及12 h，收集细胞上清用于检测丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）。按照MDA及SOD测定试剂盒说明书配制好上清混合液。将200μL上清液混合液分别加进96孔板，做好标记，使用酶标仪检测A值，波长为532 nm，按照说明书进行MDA含量和SOD活力计算。

2.3 统计学方法

采用SPSS24.0软件进行数据分析。计量资料服从正态分布，数据采用（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 4组ANA-1细胞活力比较

与对照组比较，低、中、高剂量BBR组细胞活性均无明显区别，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

3.2 4组TLR4 MFI比较

与荧光抗体组比较，模型组MFI明显减弱；与模型组比较，模型＋高剂量BBR组MFI明显增强，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表2 4组ANA-1细胞活力比较（±s）Table 2 Comparison of the activity of ANA-1 cells in four groups（±s）

组别对照组低剂量BBR组中剂量BBR组高剂量BBR组n3 3 3 3细胞活性（吸光值）0.29±0.04 0.29±0.01 0.29±0.05 0.29±0.06

表3 4组TLR4平均荧光强度比较（±s）Table 3 Comparison of the mean fluorescence intensity of TLR4 in four groups（±s）

注：与荧光抗体组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。Note:Compared with the fluorescent antibody group,1)P＜0.05;compared with the model group,2)P＜0.05.

组别对照组荧光抗体组模型组模型＋高剂量BBR组n3 3 3 3 MFI 43.37±17.55 1 069.69±92.39 677.14±79.721）923.70±102.102）

3.3 6组IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平比较

与对照组比较，模型组IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA水平明显升高；与模型组比较，模型＋低、中、高剂量BBR组IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平均明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表4。此外，研究结果显示，与模型组比较，模型＋抑制剂组、模型＋高剂量BBR组IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平均明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

表4 6组IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平的比较（±s）Table 4 Comparison of mRNA levels of IL-1β，IL-6 and TNF-αin six groups（±s）

注：与对照组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。Note:Compared with the control group,1)P＜0.05;compared with the model group,2)P＜0.05.

组别对照组模型组高剂量BBR组模型＋低剂量BBR组模型＋中剂量BBR组模型＋高剂量BBR组n3 3 3 3 3 3 IL-1βmRNA 1.00±0.20 1.52±0.191）0.95±0.28 0.99±0.372）0.54±0.132）0.37±0.092）IL-6 mRNA 1.00±0.07 4.78±0.201）1.03±0.12 0.86±0.212）0.85±0.112）0.75±0.082）TNF-αmRNA 1.00±0.12 1.85±0.261）1.05±0.23 0.80±0.312）0.70±0.192）0.61±0.042）

表5 6组IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平比较（±s）Table 5 Comparison of mRNA levels of IL-1β，IL-6 and TNF-αin six groups（±s）

注：与对照组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。Note:Compared with the control group,1)P＜0.05;compared with the model group,2)P＜0.05.

组别对照组模型组抑制剂组模型＋抑制剂组高剂量BBR组模型＋高剂量BBR组n3 3 3 3 3 3 IL-1βmRNA 1.00±0.05 2.54±0.181）1.06±0.15 0.64±0.142）0.83±0.24 0.19±0.022）IL-6 mRNA 1.00±0.19 2.16±0.261）0.83±0.13 0.85±0.242）0.93±0.09 0.43±0.122）TNF-αmRNA 1.00±0.07 1.61±0.161）1.00±0.17 0.40±0.052）0.81±0.11 0.23±0.042）

3.4 6组IL-1β、IL-6、TNF-α含量比较

与对照组比较，模型组IL-1β、IL-6、TNF-α的含量明显升高；与模型组比较，模型＋低、中、高剂量BBR组IL-1β、IL-6、TNF-α含量均明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表6。此外，研究结果显示，与模型组比较，模型＋高剂量BBR组及模型＋抑制剂组IL-1β、IL-6、TNF-α含量均明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表7。

表6 6组IL-1β、IL-6、TNF-α含量比较（±s） pg/mLTable 6 Comparison of content of IL-1β，IL-6 and TNF-αin six groups（±s） pg/mL

注：与对照组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。Note:Compared with the control group,1)P＜0.05;compared with the model group,2)P＜0.05.

组别对照组模型组高剂量BBR组模型＋低剂量BBR组模型＋中剂量BBR组模型＋高剂量BBR组n3 3 3 3 3 3 IL-1β 5.79±0.27 6.98±0.021）5.56±0.10 6.61±0.072）6.13±0.112）4.10±0.292）IL-6 13.63±0.21 32.65±1.061）13.26±0.69 10.62±0.292）4.13±0.282）3.33±0.132）TNF-α 105.48±0.79 429.34±7.791）105.96±0.62 111.13±0.372）90.99±0.792）73.67±0.992）

表7 6组IL-1β、IL-6、TNF-α含量比较（±s） pg/mLTable 7 Comparison of content of IL-1β，IL-6 and TNF-αin six groups（±s） pg/mL

注：与对照组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。Note:Compared with the control group,1)P＜0.05;compared with the model group,2)P＜0.05.

组别对照组模型组抑制剂组模型＋抑制剂组高剂量BBR组模型＋高剂量BBR组n3 3 3 3 3 3 IL-1β 5.36±0.21 6.66±0.071）4.52±0.37 4.36±0.322）5.39±0.24 5.14±0.032）IL-6 10.41±0.31 35.50±0.351）6.32±2.27 5.62±0.422）11.55±0.09 10.28±0.372）TNF-α 101.87±0.92 434.96±14.071）86.18±1.05 73.67±1.652）98.96±0.84 93.32±2.022）

3.5 6组AngⅡ干预后TLR4相关蛋白磷酸化表达比较

3.5.1 6组AngⅡ干预45 min TLR4相关蛋白磷酸化表达比较与对照组比较，模型组干预45 min后p65、IRF-3蛋白的磷酸化表达明显上调，模型＋低、中、高剂量BBR组干预45 min后p65、IRF-3蛋白的磷酸化表达明显下调。见图1。

3.5.2 6组AngⅡ干预15、30、45 min TLR4相关蛋白磷酸化表达比较与对照组比较，模型组干预15 min后ERK、p38蛋白磷酸化表达明显上调，干预30 min后JNK蛋白磷酸化表达明显上调，干预45 min后p65、IRF-3蛋白磷酸化表达明显上调。而模型＋高剂量BBR组、模型＋抑制剂组p65、IRF-3、ERK、p38、JNK蛋白磷酸化表达均明显下调。见图2。

图1 6组干预45 min TLR4相关蛋白磷酸化表达比较Figure 1 Comparison of phosphorylation expression of TLR4-related protein after intervention for 45 min in six groups

图2 6组AngⅡ干预15、30、45 min TLR4相关蛋白磷酸化的表达比较Figure 2 Comparison of phosphorylation expression of TLR4-related protein after intervention for 15,30,45 min in six groups

3.6 6组AngⅡ干预后TLR4相关蛋白磷酸化表达比较

3.6.1 6组AngⅡ干预12 h TLR4相关蛋白磷酸化表达比较与对照组比较，模型组干预12 h后TLR4、MyD88、AP-1蛋白的表达以及p65、IκBα、JNK蛋白的磷酸化表达明显上调。模型＋低、中、高剂量BBR组TLR4、MyD88、AP-1蛋白的表达以及p65、IκBα、JNK蛋白的磷酸化表达均明显下调。见图3。

图3 6组干预12 h TLR4相关蛋白磷酸化表达比较Figure 3 Comparison of phosphorylation expression of TLR4-related protein after intervention for 12 h in six groups

3.6.2 5组AngⅡ干预12 h TLR4相关蛋白磷酸化表达比较与对照组比较，模型组干预12 h后TLR4、p-p65的表达明显上调，而模型＋高剂量BBR组、模型＋抑制剂组、模型＋抑制剂＋高剂量BBR组TLR4、p-p65蛋白表达均明显下调。见图4。

图4 5组干预12 h TLR4相关蛋白磷酸化表达比较Figure 4 Comparison of phosphorylation expression of TLR4-related protein after intervention for 12 h in five groups

3.7 5组MDA含量和SOD活力比较

与对照组比较，模型组MDA含量明显上调，SOD活力明显下调，差异具有统计学意义（P＜0.05）。模型＋低、中、高剂量BBR组MDA含量均明显下调，SOD活力明显上调，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表8。

表8 5组MDA含量和SOD活力比较（±s） nmol/mLTable 8 Comparison of MDA content and SOD activity in five groups（±s） nmol/mL

注：与对照组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。Note:Compared with the control group,1)P＜0.05;compared with the model group,2)P＜0.05.

组别对照组模型组模型＋低剂量BBR组模型＋中剂量BBR组模型＋高剂量BBR组n3 3 3 3 3 SOD 7.91±0.07 6.09±0.041）7.20±0.062）7.49±0.042）7.69±0.042）MDA 0.49±0.02 0.69±0.021）0.49±0.012）0.45±0.012）0.44±0.022）

4 讨论

4.1 BBR能有效抑制TLR4蛋白“内吞”

由于配体的刺激作用，活化的TLR4分别通过招募MyD88接头蛋白TRIF、TRAM后启动下游信号，同时使配体与TLR4复合体转移至胞内，细胞膜表面的TLR4受体数量减少［10-11］。本研究结果显示，与荧光抗体组比较，模型组MFI明显减弱，这提示AngⅡ诱导了细胞膜上TLR4蛋白数量减少，即发生“内吞”，这可能是因为AngⅡ与细胞表面TLR4结合，内吞转移至胞质内。与模型组比较，模型+高剂量BBR组MFI明显增强，这提示BBR能够阻断AngⅡ诱导的TLR4蛋白“内吞”。这可能与以下因素有关：AngⅡ能够与TLR4的辅助蛋白MD2结合进而招募TLR4，这种直接的相互作用类似于LPS与MD2的结合，导致AngⅡ-MD2-TLR4复合物的形成，激活信号转导以及接头蛋白的募集［12］，但这一过程并不依赖于AT1R信号通路［13］。BBR可能通过竞争性抑制AngⅡ与MD2的结合来抑制细胞膜表面的TLR4减少，这一作用可能和BBR竞争性抑制LPS与MD2的结合类似。

4.2 BBR能有效抑制TLR4信号通路的转导和IL-1β、IL-6、TNF-α的转录

研究显示，TLR4的胞内区信号主要通过2条途径被激活，MyD88依赖非依赖途径活化下游信号转导［14-15］，最终MAPK、NF-κB以及IRF3信号通路被激活，调节炎性应答及促炎因子（如TNF-α、IL-6、IL-1β）的表达，导致炎性应答的发生发展［16-17］。本研究结果显示，AngⅡ诱导ANA-1细胞15、30、45 min能够诱导ERK、p38、JNK、p65、IRF-3的磷酸化，而TAK242抑制剂的干预均能够抑制上述蛋白的磷酸化水平，这提示了AngⅡ瞬时刺激可能会导致ERK、p38、JNK、p65、IRF-3蛋白磷酸化，即使在AngⅡ诱导12 h（滞后性效应）后依然能够促进TLR4、MyD88、IκBα、AP-1的蛋白表达以及JNK的磷酸化。而模型＋高剂量BBR组、模型＋抑制剂组p65、IRF-3、ERK、p38、JNK蛋白的磷酸化表达均明显下调，这提示BBR能够有效抑制上述蛋白及磷酸化表达。IL-1β、IL-6、TNF-α是炎性应答触发后产生的细胞因子，当巨噬细胞被外界刺激后，会产生大量促炎因子和早期炎性应答标记物，在组织损伤、微生物感染和免疫系统激活的条件下分泌和释放［18-20］。有研究表明，抑制TLR4/MAPK以及NF-κB信号通路可以进而抑制炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α转录［21-22］。本研究结果显示，AngⅡ能够诱导IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA水平及含量明显上调，而BBR、TLR4信号通路抑制剂TAK242均能够明显下调AngⅡ诱导的上述促炎因子mRNA水平及含量。这可能与以下因素有关：①AngⅡ能够诱导TLR4的活化，激活下游级联反应，其中包括激活MAPK信号通路关键蛋白ERK、p38、JNK的磷酸化以及AP-1蛋白水平，并且能够使IκBα蛋白与NF-κB解离并磷酸化，激活NFκB信号通路，从而调控了炎症因子（如IL-1β、IL-6、TNF-α等）的转录。②BBR能够通过TLR4信号通路抑制AngⅡ诱导的相关蛋白表达，进而抑制促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的转录，即BBR能够通过TLR4信号通路抑制AngⅡ诱导的炎性应答。

4.3 BBR能有效抑制氧化应激反应

TLR4信号通路的激活能够刺激还原型辅酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶［23］，导致活性氧（reactive oxygen species，ROS）转化形成［24］。ROS水平的失衡激活NF-κB途径，导致NF-κB的磷酸化和核转位，促进IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌，增加炎性应答反应程度［25］。本研究结果显示，模型组MDA含量明显上调，SOD活力明显下降，说明AngⅡ能够诱导ANA-1细胞的氧化应激损伤。而模型+低、中、高剂量BBR组MDA含量均明显下调，SOD活力明显上调，这提示，低、中、高剂量BBR能够改善AngⅡ诱导的ANA-1细胞的脂质过氧化程度及抗氧化能力，降低AngⅡ造成的氧化应激损伤，保护ANA-1细胞，进而降低炎性应答的发生。这可能与以下因素有关：BBR通过抑制TLR4信号通路的激活进而抑制氧化应激的发生发展。BBR抑制氧化应激反应，间接抑制了ROS激活NF-κB信号通路的作用，维持活性氧水平和抗氧化能力的动态平衡，在炎性应答中发挥了重要的作用。

5 小结

BBR能够通过抑制TLR4蛋白的“内吞”，从而抑制AngⅡ诱导的TLR4信号通路的异常激活，并且抑制下游NF-κB和MAPK信号的转导，降低促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平和含量，调控炎性应答。此外，BBR还能够改善AngⅡ诱导的ANA-1细胞的脂质过氧化程度的增加和抗氧化能力的减弱，降低AngⅡ造成的氧化应激损伤，保护ANA-1细胞。AngⅡ诱导炎性应答的发生，造成靶器官损伤，导致心脑血管疾病、胰岛素抵抗、肾脏疾病、肺动脉高压等疾病病理发展过程。其具体作用机制可能是BBR可通过竞争性抑制TLR4信号通路的激活，减轻炎性应答。这也许可以为临床治疗AngⅡ刺激产生的炎症性疾病提供新思路，但需要进一步通过大样本临床随机对照试验加以验证。此外，BBR对TLR4信号通路的抑制作用是否呈剂量依赖性也有待进一步研究。