流产组织染色体整倍性对同一取卵周期冻融胚胎移植妊娠结局的影响

赵伟娥，陈攀宇，李玉洁，贾磊，梁晓燕

(中山大学附属第六医院生殖医学研究中心，广州 510000)

自然流产占妊娠总数的10%～15%，与胚胎、母体、父亲以及环境等因素有关，胚胎非整倍体是导致流产最常见原因，占50%～60%[1]。因此，检测流产组织的染色体对后续妊娠具有重要指导意义。辅助生殖(ART)治疗中，常采用控制性促排卵(COH) 增加卵母细胞数目，使患者有剩余胚胎进行优选并冷冻，为患者提供尽可能多的移植机会。对发生过自然流产，尤其是因胚胎非整倍体导致流产的夫妇而言，移植同一取卵周期的胚胎，自然流产或胚胎染色体异常的风险会增加，从而陷入是否丢弃这些胚胎或行胚胎植入前非整倍体检测(PGT-A)的困惑。目前，关于一次胚胎非整倍体导致流产是否影响同一取卵周期来源胚胎的妊娠结局，尚无相关研究。本研究对流产组织染色体结果为整倍体或非整倍体时移植同一取卵周期来源胚胎后的临床结局进行分析，观察流产组织染色体整倍性对冻融胚胎移植(FET)的妊娠结局的影响，以期为同一取卵周期的冷冻胚胎再次移植提供指导。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2012年3月至2020年1月在本中心行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)患者的临床资料，对其稽留流产所行的清宫术中留取的流产组织行染色体核型分析，收集同一取卵周期有冷冻胚胎并行FET的相关临床数据。排除标准包括：(1)既往有自然流产史；(2)反复种植失败；(3)双方或一方有染色体异常；(4)生殖道畸形等。

二、研究方法

1.促排卵与胚胎培养：根据患者年龄、卵巢储备、既往对促排卵药物的反应性等，个体化选择长方案或者拮抗剂方案。根据男方精液情况，行常规IVF或卵胞浆内单精子注射(ICSI)，18～20 h后观察受精情况，出现两个原核为正常受精。72 h后观察胚胎并评分，对于符合囊胚培养条件的胚胎，转移至囊胚培养液中继续培养[2]，在第5天观察胚胎质量并评分，评分标准参考Gardner评分系统[3]。

2.胚胎冷冻与复苏：胚胎冷冻采用玻璃化冷冻方法[2]。冷冻时使用三种平衡溶液：A液为含12 mg/ml人血清白蛋白的4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES，Quinn’s，美国)平衡溶液，B液为A液+7.5%乙二醇+7.5%二甲亚砜，C液为A液+15%乙二醇+15%二甲亚砜。将胚胎依次放入A液2 min、B液2 min以及C液1 min后，30 s内将胚胎转移至冷冻载体，保存在液氮中。胚胎复苏时，将胚胎从液氮中取出，在含0.33 mol/L蔗糖+10%血清蛋白替代物的HEPES溶液中平衡2 min，然后转移至含0.2 mol/L蔗糖+10%血清蛋白替代物的HEPES溶液中平衡3 min，再转移至含10% 血清蛋白替代物的HEPES溶液中平衡5 min后，转移至培养液中继续培养。

3.冻融周期的内膜准备：自然周期(NC)：既往排卵规律的患者，定期经阴道B超及血雌激素(E2)水平监测卵泡发育情况以及内膜厚度，确定排卵时间，排卵后若内膜≥7 mm，第3天移植卵裂期胚胎或第5天移植囊胚期胚胎。替代周期(HRT)：既往无规律排卵的患者，月经第2～3天使用戊酸雌二醇(拜耳制药，德国)，根据内膜生长情况与E2水平调整用药，当内膜厚度≥7 mm且用药时间不少于10 d时，给予阴道用黄体酮(Besins，比利时)转化内膜，第3天移植卵裂期胚胎，第5天移植囊胚期胚胎。

4.流产组织收集、培养与染色体核型分析：稽留流产患者常规行清宫术，术中在无菌条件下将绒毛组织与蜕膜、血块等分离，留取绒毛组织并置入含有抗生素的培养液中送入实验室行绒毛细胞培养。每个标本采取双线培养，将绒毛组织用胶原酶II和胰酶消化后置入37℃培养箱中培养。当绒毛细胞生长到适宜密度后回收细胞固定，制备染色体核型分析玻片，将玻片放入胰酶溶液中静置20～30 s，甩干后放入吉姆萨染液中染色4～5 min，蒸馏水中漂洗一次晾干。染色体结果判读参照人类细胞遗传学命名国际体制[4]。每例染色体标本计数分析20个以上核型，如果检出核型异常，则分析50个核型，存在嵌合体则分析100个核型。

5.妊娠结局及观察指标：临床妊娠定义为阴道B超证实的胚胎位于子宫内且有胎心者；早期流产定义为12周之前的胚胎丢失；不论孕周大小，至少获得一个存活婴儿定义为活产。观察指标如下：临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%、早期流产率=早期流产周期数/移植周期数×100%、活产率=活产数/移植周期数×100%、累积活产率=所有活产数/患者例数×100%。

三、统计学分析

结 果

一、一般临床资料

本研究共纳入380例患者、539个周期。根据流产组织染色体结果将其分为两组：整倍体组(206例患者、292个周期)与非整倍体组(174例患者、247个周期)。整倍体组取卵时年龄显著小于非整倍体组(P<0.05)，AMH值显著高于非整倍体组AMH(P<0.05)，原发不孕占比显著高于非整倍体组(P=0.02)。两组患者BMI与流产孕周比较均无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表1 整倍体组与非整倍体组临床资料[(-±s)，%]

二、两组患者同一取卵周期冷冻胚胎移植情况比较

两组患者内膜转换日的内膜厚度与E2水平、平均移植胚胎数、优质胚胎数、平均移植周期数均无统计学差异(P>0.05)，囊胚移植占比在两组中无显著差异(P>0.05)。整倍体组中，替代周期占比更高，差异有统计学意义(P=0.002)(表2)。

表2 两组患者同一取卵周期冷冻胚胎移植情况比较[(-±s)，%]

三、两组患者同一取卵周期FET的妊娠结局

两组患者的临床妊娠率、早期流产率、活产率及累积活产率均无统计学差异(P>0.05)(表3)。

表3 两组患者同一取卵周期FET的妊娠结局比较(%)

四、两组患者临床结局的GEE分析

流产组织染色体结果与临床妊娠率及活产率无相关性(P-adj>0.05)，取卵时年龄、移植胚胎数目是影响临床妊娠率及活产率的独立危险因素(P-adj<0.05)(表4)。

表4 整倍体组与非整倍体组临床结局的GEE分析

讨 论

本研究分析了流产组织染色体整倍性对移植同一取卵周期冷冻胚胎的妊娠结局的影响，比较整倍体组与非整倍体组的临床妊娠率、早期流产率、活产率及累积活产率。结果表明，两组患者的妊娠结局无显著差异，在排除取卵时年龄、移植胚胎数目等混杂因素后，整倍体组与非整倍体组的临床妊娠率、早期流产率、活产率及累积活产率均无显著差异。

自然流产给女性带来巨大的心理创伤，其中创伤后应激反应、焦虑和抑郁可持续数月，并且患者会陷入对再次流产的担忧与恐惧中[5]。既往研究显示，流产可增加再次流产及染色体异常的风险；羊水穿刺结果表明，既往无流产史，染色体异常率为1.39%，若有一次流产史，染色体异常率为1.67%；当发生三次流产后，这一数值上升到2.18%[6]。但有研究提出不同意见，即流产组织染色体结果与既往流产次数无关[7-8]；年龄是影响胚胎染色体整倍性的主要因素，既往流产次数、活产次数均不影响整倍体胚胎比例[9-10]。

胚胎非整倍体是流产的主要原因，占50%～60%[1]。目前，关于流产组织染色体非整倍性对后续妊娠结局影响的研究甚少，小样本研究结果提示，第一次流产组织非整倍体与再次流产组织的染色体无关，整倍体组与非整倍体组的妊娠结局无显著差异[11-13]。迄今，针对非整倍体导致流产是否影响同一取卵周期冷冻胚胎的临床结局，暂无相关报道。

COH通过使用外源性促性腺激素(Gn)，以期获得适当数量的卵母细胞，将胚胎冷冻保存用于后续移植，从而提高累积活产率、改善临床结局。COH的原理是刺激原本因Gn不足而闭锁的同一发育阶段卵泡继续发育。理论上，同一批次卵母细胞发育轨迹与发育背景类似，它们的命运在一定程度上具有相似性。既往研究提示，卵母细胞发育异常或退化，不能预测同一批次卵母细胞的妊娠结局[14-15]，新鲜胚胎移植的结果并不影响姐妹胚胎在冻融周期的临床结局[16]。本研究结果也提示，流产组织的染色体整倍性不影响冻融周期的妊娠结局，年龄与胚胎移植数目是影响妊娠结局的独立危险因素。因此，我们推论：同一取卵周期来源胚胎，各自发育潜能不同，是相互独立的事件，妊娠结局主要受年龄及移植胚胎数目影响。

目前，PGT-A已广泛应用于ART的相关治疗。仅发生过一次染色体异常所致流产的患者，能否从PGT-A中获益，目前相关研究甚少。Zhou等[17]研究的结果表明，既往有一次染色体非整倍体异常导致流产史的患者中，PGT-A组与非PGT-A组的早期流产率、活产率及累积活产率均无显著差异，对这些患者行PGT-A临床意义不大。本研究结果也支持这一结论，在我们研究中，流产组织非整倍性并不影响姐妹胚胎的妊娠结局。

作为回顾性研究，本项工作难以避免一些局限性，例如本项工作中非整倍体组取卵时年龄显著高于整倍体组年龄，不同患者移植次数不一样导致出现重复数据引起的偏倚等。故此，我们采取了措施来改善研究的可信性：控制纳入患者的基础条件，如排除复发性流产及反复种植失败患者，排除双方或一方染色体异常患者等；采用GEE纠正了重复数据所致偏倚及年龄、移植胚胎数目等混杂因素的影响；计算累积活产率，最大限度的反映了同一取卵周期的所有胚胎情况；本研究所有数据来自于同一中心，尤其是染色体结果判读，有专门的人员负责，减少了操作人员和技术操作相关的偏差；本项工作共纳入539个周期，样本量大，可以反映其实际状况。因此，本研究结果具有可信度，有助于对临床治疗方案提供参考资料，给患者咨询提供指导意义。

综上所述，非整倍体组与整倍体组比较，两组的临床妊娠结局无显著差异，一次染色体非整倍体导致流产后，移植同一取卵周期的冷冻胚胎是安全有效的。由于本研究为单中心研究，后续还需要更多研究来证实丢弃这些姐妹胚胎或对其行PGT-A的实际临床意义。