释氧光动力疗法对根管内粪肠球菌清除效果的体外研究

根管内的持续性感染未得到消除是根管治疗失败的主要原因，主要由粪肠球菌等顽固性致病菌引起

。单独使用机械仪器预备无法彻底清理根管系统，光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）可杀灭根管内细菌，在根管消毒、辅助控制根管感染中效果较好

。PDT 在根管内发挥杀菌效果，需要激光、光敏剂、氧三个重要因素共同作用，即光敏剂在根管内均匀扩散后，通过激光一定波长的照射，在氧气的参与下，产生活性氧和单线态氧，从而起到杀菌作用

。受自身解剖结构影响，根管内部及牙本质小管深处不可避免存在氧不足的情况，影响了PDT 治疗效果

。常用光敏剂亚甲基蓝（methylene blue，MB）的光照波长为660 nm，对粪肠球菌杀菌效果较好，对MB 配方进行改性后可进一步提高PDT 杀菌能力，但目前对释氧配方光敏剂的研究仍较少

。本研究拟在前期研究的基础上，通过构建单根管离体前牙粪肠球菌根管感染模型，观察释氧MB 配方的PDT 对根管内粪肠球菌的杀菌效果，为临床应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 主要仪器和材料

粪肠球菌标准菌株（ATCC29212，ATCC，美国），脑⁃心浸液（brain heart infusion，BHI）（海博，中国），戊二醛溶液（上海生工，中国），PBS（上海生工，中国），1%次氯酸钠（朗力生物，中国），生理盐水冲洗液（双鹤，中国），MB（Sigma，美国），全氟十氢化萘（Sigma，美国），H

O

（遂成，中国），Triton⁃X100（上海生工，中国），N⁃乙酰基⁃L⁃色氨酸酰胺（N⁃acetyl⁃L⁃tryptophan amide，NATA）（Sigma，美国），1，3⁃二苯基异苯并呋喃（1，3⁃diphenylisobenzo⁃furan，DPBF）（Sigma，美国）。

扫描电镜（S3400，日立，日本），ProTaper 机用马达和锉（登士柏，瑞士），光动力口腔治疗仪（HHL⁃1 000，哌威，加拿大），液相色谱仪（LC⁃20A，岛津，日本），分光光度计（UV⁃2600，岛津，日本）。

1.2 不同配方MB 的光氧化活性和单线态氧产生速率测定

1.2.1 分组 参照文献所述

，分为MB 组和释氧MB 组，MB 组采用50 μmol/L MB 溶液，释氧MB 组采用50 μmol/L MB 混合在释氧乳液中（全氟十氢化萘∶H

O

∶Triton⁃X100=75∶24.5∶0.5）

。

1.2.2 光氧化活性测定 浓度为10 μmol/L 的荧光测定模型底物NATA与不同测试配方中的50 μmol/L MB 混合（总体积3 mL）。采用660 nm 波长，30 mW功率辐照测试溶液诱导氧化剂的产生，激光尽量接近测试液体表面而不接触。利用液相色谱仪测量NATA 浓度在290 nm 波长随着辐照时间增加的下降速率，NATA 浓度的下降速率代表了MB 或释氧MB 的光氧化活性。检测间隔为5 min，检测20 min。所有实验重复3 次。

陈丰连等[31]建立了以高效液相色谱法(HPLC)同时测定凉粉草药材中熊果酸和齐墩果酸含量的方法，该方法简单、准确、可靠。利用该方法可测定不同采收期、不同产地等不同批次的仙草熊果酸和齐墩果酸含量。冷桂华[32]利用反相高效液相层析法(RP-HPLC)测定了仙草不同部位的熊果酸和齐墩果酸含量，发现仙草叶的熊果酸和齐墩果酸含量均高于仙草茎和全仙草的含量；同一部位仙草的熊果酸含量明显高于齐墩果酸含量，熊果酸含量约为齐墩果酸含量的2.5～2.8倍。

1.3 粪肠球菌根管感染模型的构建

每组根管内处理方法及细菌培养计数方法同1.4 所述。实验及计算方法参考文献

。

NATA 浓度的下降速率代表了光氧化活性。10 min（

= 3.570，

= 0.023）、15 min（

= 3.507，

=0.025）、20 min（

= 2.904，

= 0.044）时，释氧MB 组NATA 浓度的下降速率高于MB 组下降速率（

＜0.05）（图1a）。

1.4 光动力疗法对根管内粪肠球菌的清除效果

取粪肠球菌根管感染的离体牙根30 个，随机分为常规根管治疗组、MB⁃PDT 治疗组和释氧MB⁃PDT 治疗组，每组10 个离体牙根。同时另取10 个离体牙根不做任何处理，获取根管内样本作为细菌测定基线。常规根管治疗组采用1%次氯酸钠溶液常规处理根管1 min；MB⁃PDT 治疗组采用1%次氯酸钠溶液处理根管后，注入50 μmol/L MB 溶液静置1 min，采用光动力治疗仪照射1 min（660 nm，30 mW），重复此步骤1 次；释氧MB⁃PDT 治疗组采用1%次氯酸钠溶液处理根管后，注入50 μmol/L MB 释氧乳化溶液静置1 min，采用660 nm 激光照射1 min，重复此步骤1 次。

最好的检验方法当然是试射，但不可能把所有炮弹都拿出去射了，所以存在一个抽样检查的问题．类似的问题很多，例如，工厂生产的产品在上市之前一般也需要技术部门做合格鉴定，工商部门也会对市场上的商品做合格检查，但由于这些产品都有包装，一旦打开，这些产品就不能再卖了，所以不可能将所有产品都拆开检查．即使是不需要损坏产品包装，也可能由于数量的庞大，很难对每件产品都做检验，只能抽取部分产品做鉴定．在此基础上引入简单随机抽样的概念．

利用无菌纸尖在根管内取样，静置60 s 后，放入盛有1 mL 无菌水的无菌离心管中并充分振荡10 s。将细菌样本在BHI 肉汤培养基中37 ℃下培养。样本在孵育24 h 后，分别检测每个培养皿上菌落形成情况并进行细菌计数。将未处理样本的细菌数作为计算基线，按下列公式计算各组细菌的清除率：

在此种背景下，农业的发展方式需要转变、要从供给入手改善供给结构，这才有了农产品供给侧改革。但是在今后的农业建设与发展中，供给侧改革要想得到有效的推进，除了国家的宏观调控之外，农民也得转变发展观念。通过施化肥、打农药、单纯追求产量增长的生产方式已经不符合时代的潮流，农民还要调整种植结构，多生产绿色有机食品，满足消费者的需求来提升经济效益。

取粪肠球菌根管感染的离体牙根15 个，随机分为常规根管治疗组、MB⁃PDT 治疗组和释氧MB⁃PDT 治疗组，每组5 个离体牙根，同时另取5 个离体牙根不做任何处理，获取根管内不同部位牙本质小管内样本作为细菌测定基线。将牙根沿牙体长轴纵向劈开，将牙根三等份分为根上、根中、根下三段，采用小球钻（直径1 mm）在根上、根中、根下三段牙根部位的中心部位获取深度1 000 μm 的牙本质碎屑，为保证每个部位收集的牙本质碎屑尽可能保持一致，应在球钻头部刚好完全没入根管内壁时停止取样，同时为了避免产热过多，应该间断钻磨，随后用无菌水将碎屑转移到离心管中并充分振荡10 s。

1.5 光动力疗法对不同根管部位牙本质小管内粪肠球菌的清除效果

其中M 为基线细菌数，N 为处理后的细菌数。实验及计算方法参考文献［9］。

粪肠球菌的根管感染模型构建参考以往文献报道

，具体如下。获取上海市口腔医院口腔颌面外科临床拔除的63 个根尖发育完成、单根管离体牙（审批号：沪口防伦审［2020］014 号），将牙根表面清理干净，修整牙体，保留牙根9 mm 的长度。采用ProTaper 镍钛机械进行常规根管预备，根管冲洗液交替冲洗根管，冲出碎屑。离体牙根清理完成后，121 ℃高温高压消毒20 min，杀灭牙根内微生物。随后，将灭菌后的离体牙根，置于粪肠球菌BHI 肉汤中进行培养3 周，细菌浓度为10

CFU/mL，每3 d 更换1 次培养基。培养3 周后，取其中3 个样本，采用高速涡轮手机沿牙体长轴纵向磨除沟槽，用骨凿沿沟槽将牙体纵向劈开，用2.5%戊二醛固定后，脱水、干燥、喷金，随后采用扫描电子显微镜观察根管内粪肠球菌的分布，确认根管感染模型构建成功。

1.2.3 单线态氧产生速率测量 浓度为100 μmol/L的单线态氧清除剂DPBF 与不同测试配方中的50 μmol/L MB 混合（总体积3 mL）。利用光度计测定DPBF 浓度在420 nm 波长随着辐照时间增加而降低的速率，分析不同配方MB 单线态氧产生的速率，检测间隔为5 min，检测20 min。所有实验重复3 次。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 各组光氧化活性和单线态氧产生速率

那么如何带动那些因病、因残致贫，或者没有劳动能力的重点贫困户实现脱贫？为解决这一问题，石柱县进一步探索了基金收益扶贫模式，即县财政通过整合各类涉农资金，建立起1亿元的资产收益扶贫专项基金，由县国有资产监管中心委托兴农担保公司负责管理。该基金的申请对象为农民合作社及参与产业扶贫的各类企业，而收益对象为重点贫困户，按照每带动一户重点贫困户5万元的标准计算申请借用额度，借用时限最长为5年。

DPBF 浓度的下降速率代表了单线态氧产生的速率。5 min（

= 6.453，

= 0.003）、10 min（

=9.166，

= 0.001）、15 min（

= 15.600，

＜0.001）、20 min（

= 10.180，

= 0.001）时，释氧MB 组中DPBF 的下降速率高于MB 组中下降速率（

＜0.05）（图1b）。

2.2 粪肠球菌感染根管模型的建立

经过3 周的培养，采用扫描电子显微镜观察根管壁表面，可以见到根管表面大量圆形的粪肠球菌附着，并侵入到牙本质小管内部，说明根管感染模型成功建立（图2）。

2.3 各组根管内粪肠球菌清除率

当代网络教学资源五花八门，为了促进网络教育的不断创新和改革，学校和社会应该做好网络教育的先锋和引路者，教师有责任将自己的知识无偿传授给学生，为了能让学生更好地吸收知识，引导学生完成自主性学习，提供给学生质量优于市面的以取利为目的的网络教学机构或者教学平台，学校有义务为教师的网络教学活动提供平台，社会也同样有义务为地方网络教育过程提供支持与相关所有的服务。

常规根管治疗组根管内粪肠球菌清除率为（90.43±1.43）%，MB⁃PDT治疗组为（95.95±0.77）%，释氧MB⁃PDT 治疗组为（98.57 ± 1.19）%，三组根管内粪肠球菌的清除率差异具有统计学意义（

=16.5，

＜0.05），释氧MB⁃PDT 组粪肠球菌清除率高于MB⁃PDT 治疗组和常规根管治疗组，MB⁃PDT 治疗组高于常规根管治疗组，差异均具有统计学意义（

＜0.05）。

2.4 不同根管部位牙本质小管内粪肠球菌清除率

三组根管不同部位（根上、根中、根下段）牙本质小管内粪肠球菌清除率如表1 所示。根上段，三组清除率差异无统计学意义（

= 33.7，

＞0.05）；根中段，释氧MB⁃PDT 组清除率高于常规根管治疗组，差异具有统计学意义（

＜0.05）；根下段，MB⁃PDT 治疗组清除率高于常规根管治疗组，释氧MB⁃PDT 组高于常规根管治疗组和MB⁃PDT 治疗组，差异均有统计学意义（

＜0.05）。

利用Msatcommander软件对广西地不容的unigene序列进行SSR位点搜索。筛选标准：单碱基重复不予统计，二碱基至少重复6次、三至四碱基至少重复5次、五至六碱基至少重复3次。

3 讨 论

粪肠球菌是一种革兰氏阳性兼性厌氧菌，在根管内可形成生物膜，在牙本质小管内的潜行深度可达1 000 μm，能够在较为恶劣的条件下生存，可以耐受根管内pH 值、温度和氧张力的巨大变化，具有较强的耐药性

。由于根管结构的复杂性以及粪肠球菌的特点，常规根管治疗方法仍然存在一定的局限性，无法完全清除根管内的粪肠球菌感染

。PDT 作为一种新型的根管消毒方法，具有诸多优点

：可以杀伤病原微生物而不对正常的人体细胞产生影响；没有激光治疗产热过多损伤牙周组织的问题；光谱杀菌，无耐药性；杀菌能力较为安全高效（无次氯酸钠的毒性）等。但是根管内氧不足的特点大大影响了PDT 的根管消毒能力。改善根管内的氧环境，可以更好提高PDT在根管消毒中的作用。研究发现，利用氧载体混合H

O

释氧的配方，提高了根管消毒效果

。本研究采用了离体牙粪肠球菌根管感染模型，利用此配方进一步研究了PDT 在根管消毒中的作用。

本研究中，释氧MB 组中的氧化活性及单线态氧的产生能力均强于MB 组，提示该配方进一步改善了反应中的内在氧环境，对后续PDT 治疗中进一步提高杀灭微生物的效果具有重要意义，与前期研究结果一致

。研究发现，PDT 与1%次氯酸钠联用可以起到较好的效果

，同时重复两次PDT 治疗的效果要明显优于单次PDT 治疗的效果，杀菌率可以有效提高到95%左右

。因而，本研究在应用1%次氯酸钠根管消毒的基础上，采用了两次PDT 治疗进行研究。结果显示，MB⁃PDT 治疗组的粪肠球菌清除率（95.95 ± 0.77）%高于常规根管治疗组，释氧MB⁃PDT 治疗组的粪肠球菌的清除率（98.57±1.19）%得到进一步提高；表明改善根管内氧环境后，提高了PDT 治疗对根管内粪肠球菌的杀菌能力。

粪肠球菌可以潜伏至牙本质小管内1 000 μm的深度，常规根管消毒采用的次氯酸钠等消毒溶液的渗透能力无法达到此深度

，同时因为根管结构形态的复杂性（如根下段根管分歧、侧枝等），进一步影响了根管消毒效果

。PDT 治疗中，MB溶液能更好渗透进入牙本质小管深层

，以及自由氧在根管内不同位置充分释放均是其发挥消毒作用的关键因素。因而本研究进一步研究了释氧MB 应用于PDT 治疗在根上、根中、根下不同部位的清除效果差异。结果显示，各组根上段粪肠球菌清除率差异无统计学意义；在根中段，释氧MB⁃PDT 组的粪肠球菌清除率高于常规根管治疗组，但与MB⁃PDT 治疗组无明显差异；在根下段，MB⁃PDT治疗组的粪肠球菌清除率（91.94 ± 2.47）%高于常规根管治疗组（85.44 ± 1.43）%，释氧MB⁃PDT 组粪肠球菌清除率（97.87 ± 1.14）%高于MB⁃PDT 治疗组。提示释氧PDT 主要改善了根下段内氧环境，并进一步提高了PDT 对根管内粪肠球菌的辅助清除效果。

综上，PDT 可以辅助根管治疗，提高常规根管治疗中根管内粪肠球菌清除率，释氧PDT 通过提高根管内自由氧的含量，可进一步提高PDT 的杀菌能力，且对于根下段部分效果更加明显。

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