石韦不同极性萃取物体外降血糖活性研究

庄远杯　凌梅娣　魏爱红　李榕娣　 刘小敏　聂华　张声源

摘要：为进一步明确石韦对α葡萄糖苷酶和α淀粉酶抑制作用机制，该研究以石韦95%乙醇提取物的不同极性萃取物为试材，阿卡波糖为阳性对照，采用pNPG法（pnitrophenylαDglucopyranoside， pNPG）、DNS法（3，5dinitro salicylic acid， DNS）考察石韦不同极性萃取物的α葡萄糖苷酶和α淀粉酶抑制活性，并采用酶促动力学方法与LineweaverBurk曲线分析最强活性萃取物对α葡萄糖苷酶的抑制作用类型，以期为石韦的进一步开发利用提供科学依据。结果表明：石韦水萃取物对α葡萄糖苷酶和α淀粉酶的抑制作用最强，其IC50值分别为（4.71 ± 0.72）μg·mL1、IC50 =（48.40 ± 0.32）μg·mL1，并顯著强于其他萃取物（P<0.05），且对α葡萄糖苷酶抑制作用比阿卡波糖强，对α淀粉酶抑制作用弱于阿卡波糖。阿卡波糖对α葡萄糖苷酶和α淀粉酶抑制作用的IC50值分别为（2 857.36 ± 1.35）μg·mL1和（16.41 ± 0.63）μg·mL1。酶促动力学显示水萃取物对α葡萄糖苷酶为可逆性抑制，LineweaverBurk曲线显示为竞争性抑制。综上结果表明，石韦水萃取物具有较好的α葡萄糖苷酶和α淀粉酶抑制活性，是一种胃肠道副作用小、天然α葡萄糖苷酶抑制剂来源。

关键词： 石韦， α葡萄糖苷酶， α淀粉酶， 阿卡波糖， 提取物

中图分类号：Q946

文献标识码：A

文章编号：10003142（2022）05085505

Hypoglycemic activities of different solvent extracts

from Pyrrosia lingua in vitro

Abstract：In order to further make clear the inhibition mechanism of Pyrrosia lingua on αglucosidase and αamylase， their inhibitory activities of different polar extracts of 95% ethanol extracts of P. lingua were investigated by using pnitrophenylαDglucopyranoside （pNPG） and 3，5dinitro salicylic acid （DNS） methods with acarbose as positive control. Enzyme kinetics method and LineweaverBurk curve were used to analyze the types of inhibition of αglucosidase for the most active extract. The results showed that the IC50 values of the water extract were （4.71 ± 0.72）μg·mL1 for αglucosidase and （48.40 ± 0.32）μg·mL1 for αamylase respectively， which were significantly stronger than those of the other extracts （P < 0.05）. The inhibition of αglucosidase was stronger than that of acarbose， while the inhibition of αamylase was weaker than that of acarbose. The IC50 values of acarbose on αglucosidase and αamylase were （2 857.36 ± 1.35） μg·mL1 and （16.41 ± 0.63）μg·mL1， respectively. The enzymatic kinetics showed that the inhibitory type on αglucosidase of water extract was reversible inhibition， while the LineweaverBurk curve showed a competitive inhibition. In conclusion， the water extract from P. lingua displays potential inhibitory activity on αglucosidase and αamylase， can be the natural sources of αglucosidase inhibitor with less gastrointestinal side effects.

Key words： Pyrrosia lingua， αglucosidase， αamylase， acarbose， extract

2019年全球20～79岁糖尿病患者约4.63亿，中国约 1.164 亿（International Diabetes Federation， 2019），糖尿病已成为严重威胁人类健康的第三大疾病（杨文英，2018）。餐后血糖持续升高是引起糖尿病患者血管内皮损伤、视网膜病变等并发症的主要原因，因此有效控制餐后血糖上升有利于防治糖尿病及其并发症的发生（中华医学会糖尿病学分会，2018）。以α葡萄糖苷酶和α淀粉酶为降低餐后血糖有效分子靶标开发的阿卡波糖、伏格列波糖等药物已成为临床降低餐后血糖的首选药物。阿卡波糖对α淀粉酶具有强抑制作用，长期服用会引起肠胃胀气、腹部不适等胃肠道副作用（袁向华等，2016;苏青，2018），从中药及天然药物中寻找新型高效、副作用小的α淀粉酶和α葡萄糖苷酶抑制剂已引起医药工作者的关注，近年已取得了一系列研究成果（范莉等，2016）。C6C048C8-A9A8-4099-AD25-7A58209CA6AD

石韦（Pyrrosia lingua）为水龙骨科石韦属植物，别名石剑、石苇，主产区为广东、福建、台湾等地，具有通淋利水、泄热清肺等功效，临床用于治疗淋痛、尿血、尿路结石、肾炎等（国家药典委员会，2015）。石韦为民间防治糖尿病的常用中草药（周悦，2016），现代药理研究也证实石韦可影响小鼠血糖、糖耐量（王兵和黄传贵，2008），改善糖尿病和肾病（刘绪林等，2018）。此外，本课题组前期对梅州客家地区特色和优势药用植物进行了体外降血糖活性初步筛选，发现石韦具有较好的体外降血糖活性。为进一步明确石韦对α葡萄糖苷酶和α淀粉酶抑制作用和作用机制，本研究以阿卡波糖为阳性对照，4硝基苯αD吡喃葡萄糖苷和淀粉为底物，评价石韦95%乙醇提取物的不同極性萃取物对α葡萄糖苷酶和α淀粉酶的抑制活性，并对活性最强的萃取物通过酶促动力学方法与LineweaverBurk曲线明确其α葡萄糖苷酶的抑制作用类型，为进一步开展石韦降血糖方面的化学成分和药效学研究提供科学依据。

1材料与方法

1.1 材料

石韦于2016年4月采自广东省梅州市阴那山自然保护区，经嘉应学院医学院客家药用生物资源研究所张声源副教授鉴定为水龙骨科（Polypodiaceae）石韦属（Pyrrosia）多年生草本植物石韦（Pyrrosia lingua）。

1.2 方法

1.2.1 石韦不同极性部位萃取物的制备石韦2.0 kg，50 ℃烘干，粉碎过40目筛，加2倍量的95%乙醇，超声（200 W，40 kHz，45 ℃）提取30 min，重复3次，浓缩得浸膏（230 g）。200 g浸膏加蒸馏水混悬，萃取浓缩得石油醚萃取物（25 g），乙酸乙酯萃取物（66 g），正丁醇萃取物（53 g），水萃取物（50 g）。

1.2.2 对α淀粉酶的抑制活性参照丁华杰等（2020）的DNS法，测定不同极性部位萃取物对α淀粉酶的抑制活性，重复3 次，以阿卡波糖为阳性对照。

1.2.3 对α葡萄糖苷酶的抑制活性参照张声源等（2018）的pNPG法，测定不同极性部位萃取物对α葡萄糖苷酶的抑制活性，重复3 次，以阿卡波糖为阳性对照。

1.2.4 对α葡萄糖苷酶抑制作用的动力学试验

1.2.4.1 α葡萄糖苷酶酶活力和反应时间的确定参照温正辉等（2019）的方法，测定4.0 mmol·L1 pNPG溶液在不同酶活力（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 U·mL1）条件下的酶促反应初速率。以时间为横坐标，pNP峰面积为纵坐标作图。

1.2.4.2 α葡萄糖苷酶抑制类型的研究参考赖小燕等（2016）和李波等（2015）的方法，测定样品溶液为0、5、7 μg·mL1，pNPG溶液为4.0 mmol·L1 ，α葡萄糖苷酶活力为0.06、0.10、0.14、0.18、0.22 U·mL1的反应初速率。以酶活力为横坐标，反应初速率为纵坐标作图，判断其可逆或不可逆抑制类型。

可逆性抑制类型包括竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制和混合型抑制四种类型（宋菲等，2019）。测定样品溶液为0、5、7 μg·mL1在0.1 U·mL1 α葡萄糖苷酶，pNPG浓度为1、2、4、8、16 mmol·L1 的反应初速率。以pNPG浓度的倒数为横坐标，反应初速率的倒数为纵坐标，绘制LineweaverBurk曲线，判断其具体抑制类型。

1.3 数据统计分析

实验重复3次，采用Origin 8.5 软件进行数据处理，结果以平均值 ± 标准差（x ±s）表示，并得到相应的半数抑制浓度（IC50）。利用单因素方差分析和Duncan 法检验多组数据间差异的显著性（P<0.05或P<0.01）。

2结果与分析

2.1 石韦萃取物对α淀粉酶的抑制活性

由图1可知，石韦不同极性萃取物和阿卡波糖对α淀粉酶均具有一定的抑制作用，抑制率随质量浓度的增大而升高，呈一定的量效关系。不同极性萃取物中，水萃取物对α淀粉酶抑制活性最强，其IC50值为（48.40 ± 0.32）μg·mL1，显著低于正丁醇萃取物（530.89 ± 6.95）μg·mL1、乙酸乙酯萃取物（4 929.36 ± 1.56）μg·mL1和石油醚萃取物（50 148.70 ± 1.94）μg·mL1（P<0.05）。

2.2 石韦萃取物对α葡萄糖苷酶的抑制活性

由图2可知，石韦不同极性萃取物和阿卡波糖对α葡萄糖苷酶均具有一定的抑制作用，抑制率随质量浓度的增大而升高，呈一定的量效关系。在不同极性萃取物中，水萃取物对α淀粉酶抑制活性最强，其IC50值为（4.71 ± 0.72）μg·mL1，显著低于正丁醇萃取物（25.35 ± 0.12）μg·mL1、乙酸乙酯萃取物（193.77 ± 1.81）μg·mL1、石油醚萃取物（388.48 ± 4.71）μg·mL1、阿卡波糖（2 857.36 ± 1.35）μg·mL1（P<0.05）。

2.3 石韦水萃取物对α葡萄糖苷酶的抑制类型

2.3.1 α葡萄糖苷酶酶活力和反应时间的确定由图3可知，在反应时间0～10 min范围内，0.02～0.12 U·mL1酶活力的酶促反应进程曲线均具有良好的线性关系（各曲线在0～10 min进行线性拟合，R2均达到0.999），呈现匀速状态，故确定初速率测定采样时间点为10 min。

2.3.2 可逆或不可逆抑制类型的确定由图4可知，石韦水萃取物浓度为0、5、7 μg·mL1所得的直线均通过原点，且随石韦水萃取物质量浓度增大，直线的斜率越低，反应初速率降低，为典型的可逆性抑制特征图，由此可得石韦水萃取物对α葡萄糖苷酶属于典型的可逆性抑制。C6C048C8-A9A8-4099-AD25-7A58209CA6AD

2.3.3 竞争性、非竞争性、反竞争性和混合型抑制类型的确定由图5可知，三组直线交于纵轴，最大反应速率Vmax不变，为0.006 6 mmol·L1·min1，斜率（米氏常数Km）随抑制剂质量浓度的增大而增大，为典型的竞争性类型，表明石韦水萃取物对α葡萄糖苷酶抑制作用为竞争性抑制。

3讨论与结论

石韦为民间防治糖尿病的常用中草药（周悦，2016），现代药理研究显示石韦可影响小鼠血糖、糖耐量（王兵和黄传贵，2008），改善糖尿病肾病（刘绪林等，2018），但其作用靶点是否与抑制α葡萄糖苷酶和α淀粉酶有关的研究未见报道。实验首次发现石韦95%乙醇提取物的不同溶剂萃取物对α葡萄糖苷酶和α淀粉酶具有良好的抑制活性，丰富了石韦发挥降血糖作用的靶点研究。

目前，临床常用的α葡萄糖苷酶抑制剂由于对α淀粉酶的过度抑制，常导致胃肠道副作用（李波等，2015），顾觉奋和陈紫娟（2009）研究表明其抑制作用强度与假双糖结构连接的葡萄糖分子数目有关。本研究对石韦95%乙醇提取物的不同溶剂萃取物开展较为系统的体外α葡萄糖苷酶和α淀粉酶抑制活性评价，结果显示石韦各萃取物对α葡萄糖苷酶和α淀粉酶抑制活性大小均为水萃取物>正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物>石油醚萃取物（P<0.05），且活性最强的水萃取物对α葡萄糖苷酶的抑制类型为竞争性抑制，与阳性对照阿卡波糖相同。可能与石韦中具有与阿卡波糖抑制α葡萄糖苷酶和α淀粉酶所必须的假双糖结构有关。该结构由环己糖醇及氨基糖构成，为极性大的寡糖类似物（顾觉奋和陈紫娟，2009）。但是，石韦在体内对α葡萄糖苷酶的抑制作用是否与阿卡波糖对α葡萄糖苷酶的抑制作用相同，还需要进一步深入研究。此外，石韦萃取物对α葡萄糖苷酶的抑制活性较强，而对α淀粉酶抑制活性较弱，可能与石韦中发挥α淀粉酶抑制活性物质结构连接的葡萄糖分子数目与阿卡波糖连接葡萄糖分子数目不同有关。

本研究揭示了石韦95%乙醇提取物的不同溶剂萃取物中水萃取物具有最强的α葡萄糖苷酶和α淀粉酶的抑制活性，且对α葡萄糖苷酶为可逆竞争性抑制，表明石韦大极性化学部位中富含抑制α葡萄糖苷酶和α淀粉酶的活性成分，是天然的、胃肠道副作用小的α葡萄糖苷酶抑制剂来源。但是，石韦中抑制α葡萄糖苷酶和α淀粉酶的具体活性成分、体内外作用机制以及构效关系等还不明确，后续研究应重点对大极性化学部位开展系统的化学成分、作用机制、构效关系等研究，有望阐明石韦降血糖作用的科学内涵。

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（责任编辑李莉）

收稿日期：2021-02-23

基金项目：国家自然科学基金青年基金（81703662）;广东省科技计划项目（2020B121201013）;梅州市医药卫生科研课题 （2019B10）;梅州市社会发展科技计划项目 （2018B057）;广东省高等教育“冲补强” 提升计划重点建设学科（农业资源与环境）建设项目（粤教科函[2018]181号）;广东省大学生创新创业项目（201910582267）

第一作者： 庄远杯（1994- ），实验员，主要从事天然产物研究与开发，（Email）1294632773@qq.com。

通信作者：張声源，博士，副教授，研究方向为中药及天然药物活性成分，（Email）mcdullzhang@yeah.net。C6C048C8-A9A8-4099-AD25-7A58209CA6AD