C57BL/6小鼠和C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠行为学及针刺长强穴治疗后的对比研究

★ 林玮 刘德强 杨燕燕 周建华 俞春英 钟秋明 罗小泉 王训立（.福建中医药大学实验动物中心 福州 350；.江西中医药大学实验动物科技中心 南昌 330004）

基因敲除小鼠作为人类疾病的动物模型，在发育、代谢、神经系统、衰老和癌症等研究中起到了不可替代的作用［1］，可用来揭示疾病的机理和寻找新的治疗靶点。

脑卒中是造成人类残疾和死亡的主要疾病之一。脑卒中幸存者中有超过70%的病人患有不同程度的功能性障碍［2］。而平衡功能障碍是脑卒中患者常见的功能性障碍之一，平衡功能障碍与自理能力呈负相关，平衡功能缺失对患者的生活自理能力造成严重影响，因此，改善患者的生活能力，实施康复治疗十分必要。脑瘫指婴儿出生前到出生1个月内出现的中枢神经障碍综合征，该疾病以大脑为主要病变位置，严重影响肢体功能，出现语言、听觉、视觉、精神等障碍，同时有行为异常、癫痫及智力缺陷等［3］。脆性X智力低下综合征是由FMR1（fragile X mental retardation gene 1，FMR1 gene）基因中CGG重复序列的大规模甲基化扩增导致 FMRP（fragile X mental retardation protein，FMRP）表达缺失引起的，主要表现为智力低下、行为异常、运动功能和记忆力缺失［4］，脑卒中后遗症和脑瘫幼儿患者的表现与FMR1基因敲除小鼠的表现症状基本相符。

本实验主要通过对FMR1基因敲除小鼠和其源生小鼠的行为学比对，并通过针刺长强穴治疗后进行行为学对比，为脑瘫和脑卒中后遗症等疾病造成的运动能力损伤、智力低下、记忆力缺失和认知障碍等的动物模型研究提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

本实验的C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠于2010年由位于美国休斯顿的贝勒医学院引进，之后由福建中医药大学实验动物中心委托江苏集萃药康生物科技有限公司进行胚胎冷冻保存，并于2020年1月进行胚胎复苏后得到3只雌性杂合体小鼠，实验动物质量合格证为SCXK（苏）2018-0008。C57BL/6为C57BL/6J.KO的源生小鼠，因此于上海斯莱克实验动物有限公司购入3只雄性C57BL/6小鼠与其进行繁殖，实验动物质量合格证为SCXK（沪）2017-0005。行为学实验主要分成C57BL/6 FMR1基因敲除组（KO）和C57BL/6野生组（WT），每组小鼠20只，雌雄各半。

1.2 实验仪器

避暗实验使用的是成都泰盟科技有限公司YLS-17B避暗穿梭测试仪。跳台实验使用的是成都泰盟科技有限公司的DT-200小鼠跳台测试箱。旷场实验使用的是上海欣软XR-XM117型旷场实验视频分析系统。

1.3 方法

1.3.1 实验动物的基因鉴定

1.3.1.1 引物设计根据FMR1基因的特性设计第一对引物M2和N2，用于检测C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠中包含新霉素插入片段的等位基因片段，检测发生突变造成缺失的FMR1基因PCR扩增片段长度为800 bp；以野生型C57BL/6小鼠基因组DNA序列为模板设计引物S1和S2，用于检测野生型C57BL/6小鼠的FMR1等位基因的片段扩增片段长度为 468 bp［5］。见表 1。

表1 引物序列合成

1.3.1.2 DNA提取使用0.292 g EDTA和50 mL dd H2O配置EDTA溶液；使用1 g NaOH和10 mL dd H2O配置NaOH溶液；再使用配置好的10 μL EDTA溶液加10 μL NaOH溶液再加980 μL dd H2O配置成1 mL的裂解液。剪取待进行基因鉴定的小鼠的尾巴5 mm左右，放入已添加100 μL裂解液的离心管中，置于98 ℃的金属浴中，每隔30 min涡旋1次，1 h左右鼠尾会完全溶解，再使用低温离心机离心5 min（4 ℃，4 000 rpm）后，取150 μL上清液即为DNA。

1.3.1.3 PCR扩增PCR反应总体积为50 μL，分别加入 20 μL Mix、20 μL DEPC 水、引物各 2 μL 和DNA 1 μL。PCR扩增条件为：启动后，预热10 min，在94 ℃下预变性5 min，之后按照以下温度和时间循环 34 次：94 ℃ 30 s，50 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s。末次循环结束后于72 ℃延伸10 min，并于4 ℃保存。

1.3.1.4 1.5%琼脂糖凝胶电泳制作浓度为1.5%琼脂糖凝胶50 mL，加入5 μL的4S Red Plus核酸染色剂后，分别加入6 μL需要进行基因鉴定的小鼠的DNA，以100 V电泳1 h后于凝胶成像仪中观察并拍照。

1.3.2 对比研究

1.3.2.1 避暗实验避暗穿梭测试仪由主机和穿梭箱两个部分组成。穿梭箱由四个190 mm×190 mm×120 mm的长方体组成，呈品字型排列，分成两组，每组都有明暗两个房间，明室配有光源，暗室底部通以24 V交流电，明暗两室之间有一直径为3 cm的空洞。实验开始前，先让小鼠在避暗穿梭测试仪中适应5 min，避暗实验的时间为5 min，当实验开始时，将小鼠背朝洞口放入明室中，并开始计时，当实验小鼠第1次穿过洞口遭受电击时，将此时的时间记作该小鼠的避暗潜伏期，并记录每只小鼠在5 min内被电击的次数，即为小鼠的错误次数。每只小鼠避暗实验结束后，都需清除粪便，并用75%酒精擦拭一遍，再进行下一只小鼠的实验。

1.3.2.2 跳台实验跳台实验是检测动物被动性条件反射能力的一种实验，主要测试动物对空间位置辨知的学习记忆能力。实验每次5 min，将小鼠逐只放在相应测试室的平台上，按动开始键后，系统会自动对小鼠开始计时，当小鼠从平台跳下时，则该箱的小鼠潜伏期计时自动停止，此时计时数值则为该小鼠的潜伏期。当该小鼠受到电击后又跳回平台上时，则电击次数加1次，直至实验结束。每只小鼠实验结束后，清除粪便，并用75%酒精擦洗一遍，再进行下一只小鼠的实验。实验结束后统计跳台实验的潜伏期和错误次数。

1.3.2.3 旷场实验在一个边长为50 cm、高40 cm的正方体中，将其分成9个相等的小正方形，每只小鼠接受一次测试，将小鼠面朝墙随机放入4个拐角方格，并让其自由探索环境5 min。每只小鼠实验结束后，清除粪便，并用75%酒精擦拭一遍，再进行下一只小鼠的实验。通过软件计算小鼠的平均速度和中央区域停留的时间。

1.4 针刺治疗

将20只C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠随机分成长强穴组和非经非穴组。长强穴位于小鼠肛门与尾根之间的凹陷处，对应于人体的长强穴；非经非穴位于小鼠肛门与尾根之间凹陷处旁开1 cm左右的位置。针刺治疗时使用0.5寸毫针直刺，得气后，使用提插捻转手法，持续1 min，连续干预6 d后重复进行避暗实验、跳台实验和旷场实验。

1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行统计学处理，实验所得数据用（）表示，并采用t检验对实验结果进行比较分析。以P＜0.05为有统计学差异，P＜0.01为有显著统计学差异。

2 结果

2.1 基因鉴定

小鼠经基因鉴定，当只在800 bp位置出现条带时，为纯合的C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠；当只在468 bp的位置出现条带时，为野生的C57BL/6小鼠；而当在两个位置都出现条带的时候，为杂合的C57BL/6小鼠。

2.2 避暗实验

在连续3 d的避暗实验中，两组小鼠的潜伏期均呈上升的趋势、电击次数均呈下降趋势，而在第3天的避暗实验中，WT组小鼠的潜伏期大于KO组（P＜0.05），WT组小鼠的电击次数低于KO组（P＜0.01）。见表 2。

表2 避暗实验的潜伏期和电击次数（，n=20）

表2 避暗实验的潜伏期和电击次数（，n=20）

注：与WT组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别第1天 第2天 第3天潜伏期/s 电击次数/次 潜伏期/s 电击次数/次 潜伏期/s 电击次数/次KO 39.00±6.86 8.00±1.49 96.80±15.27 6.80±1.23 148.00±20.78* 6.60±1.81**WT 44.60±11.22 7.00±0.81 103.60±15.27 5.40±1.07 187.60±78.48 4.20±1.23

2.3 跳台实验

在跳台实验中，KO组小鼠的潜伏期及错误次数均高于WT组（P＜0.05）。见表3。

表3 跳台实验的潜伏期和错误次数（，n=20）

表3 跳台实验的潜伏期和错误次数（，n=20）

注：与WT组比较，*P＜0.05。

组别 潜伏期/s 错误次数/次KO 177.60±117.37* 1.60±1.17*WT 76.20±90.81 0.40±0.97

2.4 旷场实验

在旷场实验中，WT组小鼠的平均速度明显高于KO组小鼠（P＜0.01）；WT组小鼠在中央区域停留的时间高于KO组小鼠（P＜0.05）。见表4。

表4 旷场实验中的平均速度和中央区域停留时间（ ，n=20）

表4 旷场实验中的平均速度和中央区域停留时间（ ，n=20）

注：与WT组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 平均速度/（mm·s-1） 中央区域停留时间/s KO 53.04±17.09** 33.24±19.98*WT 80.51±16.46 50.67±32.15

2.5 针刺干预

在以上行为学实验后，将C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠分成长强穴组和非经非穴组，行针刺干预6 d，再次进行行为学实验。

2.5.1 避暗实验在避暗实验中，长强穴组小鼠的潜伏期高于非经非穴组、电击次数低于非经非穴组，且均存在显著性差异（P＜0.05）。见表5。

表5 针刺干预后的避暗潜伏期和电击次数（，n=10）

表5 针刺干预后的避暗潜伏期和电击次数（，n=10）

注：与非经非穴组比较，*P＜0.05。

组别 潜伏期/s 电击次数/次长强穴组 167.50±19.84* 5.60±1.35*非经非穴组 147.30±19.55 6.20±1.81

2.5.2 跳台实验在跳台实验中，长强穴组小鼠的潜伏期和错误次数均低于非经非穴组，且潜伏期存在显著性差异（P＜0.05）。见表6。

表6 针刺干预后的潜伏期和错误次数（，n=10）

表6 针刺干预后的潜伏期和错误次数（，n=10）

注：与非经非穴组比较，*P＜0.05。

组别 潜伏期/s 错误次数/次长强穴组 140.40±94.53* 1.40±0.97非经非穴组 177.70±117.21 1.50±1.27

2.5.3 旷场实验在旷场实验中，长强穴组小鼠的平均速度和中央区域停留时间均高于非经非穴组，且平均速度存在显著性差异（P＜0.05）。见表7。

表7 针刺干预后的平均速度和中央区域停留时间（ ，n=10）

表7 针刺干预后的平均速度和中央区域停留时间（ ，n=10）

注：与非经非穴组比较，*P＜0.05。

组别 平均速度/（mm·s-1） 中央区域停留时间/s长强穴组 57.90±17.64* 37.22±23.23非经非穴组 53.38±16.85 34.22±19.32

3 结论

C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠即以正常近交系C57BL/6小鼠为背景，利用基因敲除技术将X染色体上的FMR1基因定点灭活制备而成的动物模型，主要表现为智力低下、行为异常、运动能力的缺失和记忆力缺失，是理想的脑卒中后遗症和脑瘫等疾病的动物模型［6-7］。

避暗实验是利用小鼠天生具有的趋暗避明的习性而设计，主要是通过统计小鼠潜伏期和电击次数来判断小鼠的学习和记忆能力［8］。在本实验中，两组小鼠的潜伏期和错误次数在第3天的避暗实验中均存在显著性差异（P＜0.05），说明FMR1基因对记忆力和智力存在的影响，WT组小鼠的学习和记忆能力明显高于KO组小鼠。在跳台实验中WT组小鼠的潜伏期和错误次数均低于KO组（P＜0.05），说明KO组小鼠对空间位置辨知的学习记忆能力明显低于WT组。旷场实验是研究小鼠自发运动和探索行为的经典行为学实验。在旷场实验中，WT组小鼠的平均速度大于KO组小鼠，且存在显著性差异（P＜0.01），说明KO组小鼠的运动能力受到了影响；在中央区域的探索时间对比中，WT组也高于KO组小鼠（P＜0.05），说明KO组小鼠的趋避性下降、对环境的认知能力减弱。通过针刺长强穴治疗后，在避暗实验中，长强穴组小鼠的潜伏期高于非经非穴组、电击次数低于非经非穴组，且都存在显著性差异（P＜0.05）；在跳台实验中，长强穴组的潜伏期有显著降低（P＜0.05）；在旷场实验中，长强穴组小鼠的平均速度有显著升高（P＜0.05）。C57BL/6小鼠作为 C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠的源生小鼠，在行为学实验中，KO组小鼠主要受到FMR1基因敲除影响，其学习记忆能力和运动能力明显低于WT组小鼠。

临床研究表明，在经过治疗和干预后，大约有75%急性脑卒中患者遗留有不同程度残疾，这不仅给患者的家庭以及社会造成巨大的经济负担，同时对患者的机体和心理健康也造成严重的影响［9-10］。而急性脑卒中在经过有效的治疗后也容易遗留后遗症，如肢体障碍或言语障碍等，自理能力也明显被削弱［11］。C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠的主要表现症状与急性脑卒中和脑瘫等疾病的后遗症相似，在针刺长强穴治疗后，通过避暗实验、跳台实验和旷场实验等行为学实验的对比实验表明：C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠是理想的脑瘫、脑卒中后遗症等疾病康复的实验动物模型，并且针刺治疗对其有显著的改善效果。