39个居群款冬花综合质量评价及影响因素分析

师立伟，李美玲，崔秀文，栗孟飞*

1.定西市经济作物技术推广站，甘肃 定西 743000

2.甘肃农业大学 干旱生境作物学重点实验室，甘肃 兰州 730070

款冬花为菊科植物款冬Tussilago farfaraL.的干燥花蕾，具有润肺下气和止咳化痰功能，主治新久咳嗽、喘咳痰多和劳嗽咳血[1]。研究发现，款冬花作为清肺排毒汤中一个主要药材，在治疗新型冠状病毒感染的肺炎轻型、普通型和重型患者中发挥重要作用[2-3]。现代化学和药理学表明，款冬花含有多种有效成分，包括倍半萜内酯（如款冬酮）、酚类（如绿原酸、阿魏酸和3,4-羟基苯甲酸）、类黄酮（如芦丁、异槲皮苷和山柰酚）、多糖、生物碱和挥发油等[4-11]，具有抗炎、免疫调节、抗氧化、抗菌和抗痉挛等作用[10,12-14]。

款冬花主要分布于欧洲、亚洲、南美洲和北非[10,15]，在我国西北部广泛种植，包括甘肃、陕西、四川、青海省和内蒙古自治区[5,11]，其中甘肃省为主要产区，2020年种植面积达1300 hm2，产量约1100 t，占全国总产量的70%～80%。款冬花喜凉爽，主要生长在潮湿的环境，干燥环境也有分布[16]。Dobravalskyte等[17-18]报道称，款冬花的化学成分受生长环境（如降雨、土壤和阳光）、生长时期和遗传特性等多因素的影响。Norani等[7]研究发现，伊朗7个不同居群（海拔229～2258 m，降雨量305～1081 mm，年气温9.0～16.1 ℃），款冬花花蕾和叶片挥发油成分、总酚类含量、总黄酮含量和抗氧化能力存在显著差异。

目前，对我国不同省份和区域的款冬花质量（如绿原酸、芦丁、异槲皮苷、款冬酮和多糖）之间的差异已有相关研究报道，但多数仅限于对一个或多个化合物进行评价[19-21]。然而，款冬花综合质量优劣取决于多种成分[4-11]，因此，基于干质量、多种活性物质积累和抗氧化能力的款冬花综合质量评价至关重要。本研究利用电子天平、分光光度计和高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC），对甘肃省39个不同居群的款冬花干质量、生物活性物质含量和抗氧化能力进行了测定，采用模糊综合评价法（fuzzy comprehensive appraisal method，FCAM）对其进行综合评价，并对综合质量和生长环境之间的关系进行了相关性分析。该研究结果将为甘肃省款冬花产量和品质提升以及种植栽培规范化提供科学依据。

1 材料

款冬花花蕾于2020年12月至2021年1月采自甘肃省39个不同生态区域的野生和栽培植株（表1），花蕾于阴凉通风处干燥后，室温保存，不同区域款冬花形态特征见图1。植株样品由甘肃农业大学生命科学技术学院杨德龙教授鉴定为菊科植物款冬T.farfaraL.。

图1 39个不同居群款冬花的形态特征Fig.1 Morphological characteristics of T.farfara from 39 different populations

表1 甘肃省39个不同居群款冬花来源Table 1 Sources of T.farfara from 39 different populations in Gansu province

2 方法

2.1 绿原酸、芦丁、异槲皮苷和款冬酮的测定

2.1.1 供试品溶液的制备 称取2.0 g干燥花蕾，粉碎后置于40 mL无水乙醇具塞三角瓶中，黑暗、室温120 r/min条件下振荡提取72 h；然后4 ℃、8000 r/min离心10 min；收集上清液，用无水乙醇定容至40 mL，4 ℃保存备用。

2.1.2 混合对照品溶液的制备 分别精密称取绿原酸、芦丁、异槲皮苷和款冬酮对照品适量，用甲醇配制1 mg/mL溶液，混合后采用逐级稀释法获得250.0、50.0、20.0、8.0、3.2、1.28、0.512、0.204 8 μg/mL对照品溶液。

2.1.3 色谱条件 色谱柱为C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），进样量10 μL，体积流量1.0 mL/min，检测波长220 nm，柱温30 ℃，流动相为乙腈（A）-甲醇（B）-0.1%磷酸（C），梯度洗脱（0～30 min，14% A，86% C；30～31 min，18% A，10% B，72%C；31～36 min，100% B；36～38 min，14% A，86%C）。混合对照品和39个样品代表性色谱图见图2。

图2 混合对照品 (R) 和39个样品的HPLC图Fig.2 HPLC chromatograms of mixed references (R) and 39 samples

2.1.4 标准曲线的绘制及含量测定 将“2.1.2”项对照品溶液等比稀释成系列溶液，以峰面积（X）对绿原酸、芦丁、异槲皮苷和款冬酮质量浓度（Y）进行回归计算，得到线性方程见表2。将“2.1.1”项的供试品溶液用0.22 μm有机滤膜滤过，利用HPLC测定绿原酸、芦丁、异槲皮苷和款冬酮含量[22]。绿原酸、芦丁、异槲皮苷和款冬酮含量按照公式计算。

表2 绿原酸、芦丁、异槲皮苷和款冬酮回归方程Table 2 Standard curves of chlorogenic acid, rutin,isoquercitrin and tussilagone

W=(C×V)/(M×1000)

C分别为绿原酸、芦丁、异槲皮苷和款冬酮的质量浓度，V为提取液的体积，M为材料干质量

2.2 可溶性糖、总黄酮和总酚类成分的测定

采用硫酸-苯酚法[23]测定可溶性糖含量。吸取15 μL提取液，加入1.0 mL 9.0%苯酚溶液，振荡5 min后，加入3.0 mL浓H2SO4，充分混匀后，在室温下静置30 min；在485 nm下测定反应液的吸光（A）值，可溶性糖含量以蔗糖为对照品标定。

采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法[24-25]测定总黄酮含量。吸取80 μL提取液，加入2.0 mL蒸馏水和0.3 mL 5% NaNO2，混合振荡5 min后，加入0.3 mL 10% AlCl3，混合振荡1 min后，加入2.0 mL 1.0 mol/L NaOH，充分混合后，在510 nm下测定反应液的A值，总黄酮含量以儿茶素为对照品标定。采用福林酚试剂法[25-26]测定总酚类化合物含量。吸取15.0 μL 提取液，依次加入 2.0 mL 10%Folin-Ciocalteu和1.0 mL 7.5% Na2CO3，混合振荡5 min后，置于水浴锅中37 ℃避光反应1 h，在760 nm下测定反应液的A值，总酚类含量以没食子酸为对照品标定。以A值（X）对蔗糖、儿茶素和没食子酸的量（Y）进行回归计算，得到标准曲线方程（表3）。

表3 标准品蔗糖、儿茶素和没食子酸标准曲线方程Table 3 Standard curves of sucrose, catechin and gallic acid

可溶性糖、总黄酮和总酚类含量计算公式为:

W= (C×V2)/(V1×M×1000)C为化合物的量（μg）；V1为检测样品溶液体积（mL），V2为提取液体积（mL），M为材料干质量（g）

2.3 抗氧化能力的测定

目前，常采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）和铁离子还原/氧化能力（ferric reducing/antioxidant power，FRAP）测定总抗氧化能力，其具有快速检测的优势[25-27]。

DPPH参考Nencini等[28]的方法。吸取15.0 μL提取液，加入3.0 mL 0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液，振荡5 min后，室温黑暗条件下反应30 min，在515 nm下测定反应液的A值，计算DPPH抑制率（I），公式为：

I= (A0-A)/A0

A为样品溶液的吸光度值，A0为不加样品溶液的吸光度值

FRAP参考Benzie等[29]的方法。分别吸取15.0 μL提取液和参比（FeSO4·7H2O），加入3.0 mL FRAP溶液，振荡5 min后，37 ℃黑暗条件下反应4 min，在593 nm下测定反应液的A值，以500 μmol/L Fe2+（FeSO4·7H2O）为参比，计算公式为：

FRAP= [(A-A0)/(A1-A0)]×500

A为样品溶液的吸光度值，A0为不加样品溶液的吸光度值，A1为FeSO4·7H2O溶液的吸光度值

2.4 统计分析与综合评价

2.4.1 统计分析 每个实验重复3次，采用SPSS 26.0软件进行统计学数据分析，采用ANOVA Duncan数据差异显著性分析（P＜0.05）；采用Origin 2018软件制图。

2.4.2 综合评价 采用模糊综合评价法[30]对39个不同地区款冬花综合质量进行评价，具体公式为：

R(xi)=(xi-xmin)/(xmax-xmin)

R(xi)为隶属函数值，xi为i的函数值，xmin为x的最小值，xmax为x的最大值

D(xi)=∑[R(xi)×Ci]

D(xi)为综合评价值，Ci为权重系数

3 结果与分析

3.1 不同居群干质量的比较

由表4可知，39个不同居群款冬花花蕾干质量（0.08～0.19 g/株）存在显著性差异，其中5号样品干质量最高（0.19 g），依次为8号样品（0.17 g）和10号样品（0.16 g）。

3.2 不同居群绿原酸、芦丁、异槲皮苷和款冬酮含量的比较

由表4可知，39个居群绿原酸、芦丁、异槲皮苷和款冬酮含量也存在显著性差异。其中，绿原酸质量分数0.68～4.01 mg/g，11号样品质量分数最高（4.01 mg/g），依次为33号样品（2.64 mg/g）和22号样品（2.45 mg/g）；芦丁质量分数0.07～0.49 mg/g，11号样品质量分数最高（0.49 mg/g），依次为34号样品（0.47 mg/g）和28号样品（0.46 mg/g）；异槲皮苷质量分数0.07～0.70 mg/g，4号样品质量分数最高（0.70 mg/g），依次为22号样品（0.55 mg/g）和28号样品（0.53 mg/g）；款冬酮质量分数0.49～1.47 mg/g，22号样品质量分数最高（1.47 mg/g），依次为26号样品（1.32 mg/g）和20号样品（1.28 mg/g）。

3.3 不同居群可溶性糖、总黄酮和总酚类质量分数的比较

由表4可知，39个居群可溶性糖、总黄酮和总酚类质量分数也存在显著差异。其中，可溶性糖质量分数9.95～92.17 mg/g，12号样品质量分数最高（92.17 mg/g），依次为20号样品（74.53 mg/g）和25号样品（63.74 mg/g）；总黄酮质量分数8.90～32.80 mg/g，36号样品质量分数最高（32.80 mg/g），依次为18号样品（31.64 mg/g）和19号样品（29.59 mg/g）；总酚类质量分数4.32～18.22 mg/g，36号样品质量分数最高（18.22 mg/g），依次为19号样品（17.24 mg/g）和18号样品（16.33 mg/g）。

3.4 不同居群抗氧化能力的比较

由于39个居群活性物质含量存在较大的差异，使得其DPPH抑制率和FRAP值也存在显著差异（表4）。其中，DPPH抑制率25.33%～83.08%，18号样品抑制率最高（83.08%），依次为15号样品（81.08%）和13号样品（76.28%）；FRAP值0.98×104～8.96×104μmol/L，28号样品值最大（8.96×104μmol/L），依次为36号样品（8.49×104μmol/L）和18号样品（8.28×104μmol/L）。

表4 不同居群款冬花干质量、生物活性物质含量和抗氧化能力的比较Table 4 Comparison of dry weight, bioactive compounds contents and antioxidant capacity of T.farfara among different populations

3.5 不同居群干质量、活性物质含量和抗氧化能力的综合评价

采用FCAM对款冬花干质量、7个主要活性物质（绿原酸、芦丁、异槲皮苷、款冬酮、可溶性糖、总黄酮、总酚类）含量以及抗氧化能力（DPPH抑制率和FRAP值）进行综合质量评价，结果见表5。综合质量评价值（D值）为0.10～0.61，其中，22号样品（庄浪县水洛镇）款冬花D值最高（0.61），依次为28号样品（积石山县吹麻滩镇，D值＝0.57）和18号样品（成县小川镇，D值＝0.56）。

表5 不同居群款冬花干质量、活性物质含量和抗氧化能力的综合评价Table 5 Comprehensive appraisal of dry weight, bioactive compounds contents and antioxidant capacity of T.farfara from different populations

3.6 干质量、活性物质含量和抗氧化能力与环境因子关系的相关性分析

如表6所示，干质量与生长环境因子（海拔、年平均气温和降雨量）有一定的相关性，但没有达到显著水平。芦丁、异槲皮苷、总黄酮和总酚类含量与DPPH抑制率和FRAP值呈极显著正相关（P＜0.01）；除异槲皮苷含量与海拔呈极显著正相关（P＜0.01），其它活性物质含量和抗氧化能力与海拔相关性不显著；活性物质含量和抗氧化能力与年平均气温和降雨量呈一定程度的负相关。

表6 不同居群款冬花干质量、活性物质含量和抗氧化能力与环境因子关系的相关性分析Table 6 Correlation of dry weight, bioactive compounds contents and antioxidant capacities with environmental factors of T.farfara from different populations

4 讨论

在传统和现代医学中，款冬花广泛用于治疗呼吸道感染等相关疾病，不断扩大的市场需求推动了款冬花的大规模种植[2-3,7]。虽然前人已开展了环境条件对活性物质积累与抗氧化能力影响等方面的研究[7,17-21]，但对综合质量影响的研究鲜见报道。本研究结果表明，甘肃省39个不同居群款冬花综合质量存在较大的差异，其中，庄浪县水洛镇综合质量最高；研究还发现，环境因子对活性物质积累和抗氧化能力形成具有一定程度的影响。

很多调查研究发现，款冬花在不同的地理环境下均有分布，具有较强的环境适应能力[5,10-11,15-16]。前人通过对我国4个省份（甘肃、河北、山西省和内蒙古自治区）11个不同居群款冬花质量进行比较，发现单个花蕾干质量变化幅度较大（0.12～0.18 g）[31]。本研究发现，39个不同居群款冬花单个花蕾干质量最大相差约2.4倍（0.08～0.19 g）。以上结果表明生长环境对款冬花生长及干物质积累具有显著影响。

研究已证实，植物初级和次级代谢产物的积累受环境因素的调控[19]。前人研究发现，我国不同居群款冬花中绿原酸、芦丁、异槲皮苷、款冬酮和可溶性糖的含量最大分别相差约5.9、7.3、27.3、6.6和2.9倍[19,20,32-33]。本研究发现，39个不同居群中绿原酸、芦丁、异槲皮苷、款冬酮、可溶性糖、总黄酮和总酚类含量最大分别相差约5.9、7.2、10.6、3.0、9.3、3.7和4.2倍，DPPH抑制率和FRAP值最大分别相差约3.3和9.1倍。以上结果表明生长环境也对款冬花活性物质积累具有显著影响。

前人对款冬花质量的评价，大多基于一个或多个化合物[19-21,32-33]；比如，基于绿原酸、芦丁、异槲皮苷、款冬酮和可溶性糖含量分析，陇西县款冬花质量最高[19,21,33]；基于芦丁含量，灵台县款冬花质量最高[34]。本研究综合考虑干质量、7个活性物质积累量和体外抗氧化能力，发现甘肃省39个不同居群中，庄浪县水洛镇款冬花综合质量最高，其次是积石山县吹麻滩镇和成县小川镇。报道称，不同居群款冬花中挥发性组分和抗氧化能力的差异是由地理和环境条件（如海拔、年平均气温、降雨量、土壤和光照等）引起[7,18]，本研究发现，活性物质含量和抗氧化能力与年平均气温和降雨量呈负相关，表明适宜冷凉和干旱的生态环境可促进款冬花综合质量的形成。因此，为了提升款冬花综合质量，建议在甘肃省范围内优选综合质量评价较高的区域（如庄浪县、积石山县和成县等），同时具备冷凉和干旱的环境条件。

此外，本研究中芦丁、异槲皮苷、总黄酮和总酚类含量与抗氧化能力呈显著正相关，这与前人报道的黄酮类和酚类化合物是抗氧化能力形成的主要成分的结果一致[27,35-36]。尽管本研究分析了款冬花质量与环境因子之间的相关性，但对环境因子如何调控代谢物生物合成与积累等方面的研究还有待于进一步验证。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突