海洋源降解核苷乳酸菌的体外筛选、鉴定及其益生特性研究

蚁硕钊，李啟彬，房志家，徐春厚，刘颖*

1(广东海洋大学 食品科技学院，广东 湛江，524088)2(广东海洋大学 滨海农业学院，广东 湛江，524088)

肉类、海鲜等高嘌呤食物大量进入到国民的餐桌，导致高尿酸患病率逐年上升[1]。据2017年中国痛风现状白皮书显示，我国的高尿酸发病率达到13.3%，患者多达1.7亿，痛风患者也达到了8 000万人，高尿酸患者已超过糖尿病患者，引起大众的关注[2]。高尿酸血症常引起心血管疾病、非酒精性脂肪肝、高血压、高血脂等并发疾病[3-5]。高尿酸血症发生的原因一是人体嘌呤代谢酶表达异常引发的内源性堆积，如磷酸核糖焦磷酸合成酶活性增高，导致尿酸生成速率变高引起的内源性堆积；二是摄入过多海鲜、动物内脏、肉类等富含嘌呤的食物[6]，当富含高嘌呤核苷食物进入肠道后，在酶的作用下，转化成核苷进入血液，并在肝脏代谢成尿酸，最终形成高尿酸血症[7]。目前，治疗高尿酸血症的药物主要是别嘌醇、非布司他、丙磺舒和苯溴马隆[8]。但是，这些药物会引起患者如皮疹、肝损害等不良反应[9]。因此，寻求安全有效的控制措施成为近些年的研究热点。已有研究发现，某些乳酸菌可以降解肠道中的核苷成为不易被吸收的嘌呤碱基，并直接排出体外，从而避免了肠道对核苷的吸收，减少了肝脏转化形成尿酸的机会[10-11]。而具有益生作用的乳酸菌被发现在改善肠道功能、降血压、治疗Ⅱ型糖尿病、抗氧化、降血尿酸等方面有较好的作用[12]。同时在高尿酸人群中发现其肠道菌群紊乱，嘌呤代谢也异常，并且乳杆菌丰度减少[13]，所以乳酸菌在治疗高尿酸血症的应用上有着巨大潜力。日本学者利用格氏乳杆菌辅助治疗高尿酸血症取得较好的效果，该菌制备了供高尿酸患者使用的酸奶[14]，相关的研究成果也申请了专利[15]。XIAO等[16]从18种泡菜中分离到高效降解核苷的乳酸菌，并证实其具有降低大鼠尿酸水平的能力。通过定植在肠道中的乳酸菌，分解食物中的核苷，降低血尿酸水平已成为防治高尿酸血症的重要策略。

本研究从15种海洋动物肠道中分离出2株具有高效降解核苷的乳酸菌，并对其进行鉴定，通过溶血性、抗生素敏感性、抗氧化性、模拟人工胃肠液耐受性实验，对乳酸菌的定植能力及安全性进行评价，为开发具有降解核苷益生作用乳酸菌提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

分离材料：海星、方格星虫、金仓鱼、鯆鱼、石斑鱼、小黄鱼、马鲛鱼、弹涂鱼、银鲳鱼、墨鱼、方斑东风螺、牡蛎、华贵栉、菲律宾帘蛤、南美白对虾，捕捞自广东湛江海域；肌苷、鸟苷、腺苷(HPLC级)，成都埃法科技有限公司；甲醇、MRS培养基、血平板、胰酶、牛胆盐、血平板、金黄色葡萄球菌ATCC 6538，广东环凯微生物科技有限公司；卡那霉素、红霉素、盐酸四环素、氯霉素、四环素、链霉素、氨苄霉素，麦克林公司；胃蛋白酶，Sigma公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical, DPPH)、邻二氮菲，北京索莱宝科技有限公司；16S rDNA细菌通用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 仪器与设备

LC-20A液相色谱仪，日本岛津有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；SW-CJ-1F型单人双面超净工作台，苏州净化设备有限公司；SPX-150B-Z生化培养箱，上海博讯实业有限公司；DG250厌氧工作站，广州市华粤行仪器有限公司；PCR仪，珠海黑马医学仪器有限公司；DYY-6C电泳仪，北京市六一仪器厂；2-16KL台式冷冻离心机，德国Sigma公司。

1.3 实验方法

1.3.1 核苷降解菌的筛选

海洋动物采集后用无菌生理盐水清洗3次，并用灭菌的剪刀取各类海洋动物肠道10 g至装有90 mL生理盐水的均质袋中，于均质器中拍打均匀，并吸取0.1 mL适当稀释浓度的混悬液涂布于MRS固体平板上，37 ℃培养，利用菌落形态及镜检结果除去重复菌株。将获得的目标菌落接种于MRS液体培养基中，于37 ℃中静置培养24 h，获得种子培养液，再经过3次接种传代后，按1%接种量接种于MRS肉汤中，按照TSUBOI等[17]方法取2 mL培养液，于4 ℃、4 000 r/min离心10 min，收集菌体，再用1 mL PBS(pH 7.2～7.4)重复洗涤菌体3次。向洗涤干净沉淀的菌体中加入750 μL核苷缓冲液(1.26 mmol/L肌苷，1.26 mmol/L鸟苷，1.26 mmol/L腺苷，10 mmol/L中性磷酸钾缓冲液，pH 7.2～7.4)，重悬菌体后，置于振荡培养箱，在37 ℃，180 r/min条件下反应1 h，4 ℃、4 000 r/min离心10 min，取450 μL上清液与50 μL终止剂高氯酸溶液(0.1 mol/L)混合均匀，终止反应[18]。以不加菌体的核苷缓冲液为空白对照，通过HPLC测定上清液中肌苷、鸟苷和腺苷的浓度，分析核苷的降解率，计算如公式(1)所示。色谱条件：液相色谱仪LC-20A；反向色谱柱为Agilent-C18(4.6 mm×250 mm)；流动相为V(纯水)∶V(色谱级甲醇)=90∶10；流速1 mL/min，测定波长为254 nm，柱温30 ℃。所有进入HPLC的溶液需使用0.22 μm孔径的无菌过滤器过滤。

(1)

式中：ρ空白，不加菌体核苷缓冲液各核苷的质量浓度；ρ实验，乳酸菌与核苷培养基共培养后各核苷的质量浓度。

1.3.2 菌株的鉴定与系统发育树分析

分别以27F、1492R为正、反向引物，使用MightAmp DNA聚合酶对候选菌株进行菌落PCR，PCR体系按照LU等[19]方法。PCR的体系为30 μL：挑取少量待测单菌落作为模板，2×Mighty Ampbuffer 15 μL，MightyAmp DNA聚合酶0.75 μL，27F(10 μmol/μL)0.75 μL，1492R(10 μmol/μL)0.75 μL，双蒸水12.75 μL。反应条件：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，57 ℃退火15 s，68 ℃延伸1.5 min，35个循环；68 ℃延伸10 min；4 ℃保存10 min。取4 μL PCR产物进行质量分数1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统观察电泳条带，判断其分子质量。将符合要求的扩增PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

根据测得的16S rRNA基因序列，从EzBioCloud(EzTaxon)数据库进行同源性搜索，下载相似性高的模式菌株的16S rRNA基因序列，利用MEGA软件进行系统发育分析。

1.3.3 菌株溶血活性测定

将候选菌株点种于血平板上，同时，以点种金黄色葡萄球菌ATCC 6538作阳性对照，37 ℃静置培养24 h，观察溶血圈出现情况，判断候选菌株是否具有溶血性。

1.3.4 菌株抗生素敏感性的测定

候选菌株的抗生素敏感性测定方法采用欧洲抗菌药物敏感性试验委员会(European Committeeon Antimicrobial Suseeptibility Testing, EUCAST, http://www.eucast.org)推荐的二倍肉汤稀释法测定不同抗生素对2株候选菌株的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)。将卡那霉素、红霉素、盐酸四环素、氯霉素、四环素、链霉素、氨苄霉素作为敏感性指示抗生素添加到MRS肉汤中，调整质量浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5 μg/mL，以不含有抗生素的肉汤作空白对照，在OD600下测定候选菌株生长情况，菌株明显被抑制住生长的抗生素浓度为该抗生素对菌株的MIC值。根据欧洲食品安全局(European Food Safety Authority, EFSA)在2012年对于EUCAST标准新调整的指南，判断候选菌株的抗生素敏感性[20]。

1.3.5 菌株抗氧化活性测定

1.3.5.1 菌株对DPPH自由基清除能力测定

称取DPPH溶于无水乙醇中，使其浓度为0.2 mmol/L，存放于棕色瓶中，避光，将100 μL DPPH溶液置于试管中，加入100 μL菌株胞外上清液，振荡混匀，室温避光放置30 min 后，在517 nm 处测其吸光值(Ai)；空白组以等体积无水乙醇代替DPPH无水乙醇溶液(Aj)，对照组为等体积的无菌水代替样品溶液(Ac)，菌株对DPPH自由基清除能力计算如公式(2)所示：

(2)

1.3.5.2 菌株对·OH清除能力测定

取30 μL 0.75 mmol/L邻二氮菲溶液，依此加入60 μL 0.2 mol/L PBS(pH 7.4)和30 μL 0.75 mmol/L的FeSO4，在该混合液中加入30 μL样品溶液，最后加入30 μL 0.01%(体积分数)H2O2，37 ℃水浴60 min，分光光度计于536 nm处测吸光度Ay，同样操作，30 μL蒸馏水+30 μL样品得到空白吸光度Ab，30 μL 蒸馏水+30 μL 0.01%(体积分数)H2O2得到对照吸光度A0，·OH清除率计算如公式(3)所示：

(3)

1.3.6 菌株在人工胃肠液存活率的测定

人工胃液的配制：将PBS (pH 7.2～7.4)缓冲液用1 mol/L HCl溶液调节pH为3.0，加入胃蛋白酶(3 g/L)溶解后用0.22 μm的无菌滤膜过滤，现配现用。人工肠液的配制：用0.1 mol/L NaOH溶液将PBS(pH 7.4)缓冲液的pH调至8.0，加入1 g/L的胰蛋白酶和质量分数0.3%的牛胆盐，溶解后用0.22 μm的无菌滤膜过滤，现配现用[21]。

将乳酸菌接种活化3代后，以1%接种量接种于10 mL MRS液体培养基中，37 ℃静置培养24 h，4 ℃、4 000 r/min离心10 min收集菌体，PBS(pH 7.2～7.4)洗涤菌体3次，再调整菌体浓度至109CFU/mL。取1 mL PBS重悬的乳酸菌菌体加入到5 mL的模拟胃液中，同时加入质量分数0.5%NaCl 1.5 mL，混匀，迅速放入37 ℃培养箱中，分别培养0 h，活菌数记为N0和培养3 h，活菌数记为N3，取1 mL胃液中处理3 h的菌液，加入9 mL模拟肠液中，37 ℃继续培养，于4 h后测活菌数，记为N7。

以无菌生理盐水按1∶10梯度稀释，进行乳酸菌活菌计数，并按公式(4)(5)计算不同乳酸菌株在模拟胃肠液转运后的存活率。

(4)

(5)

1.3.7 菌株在饱腹的人工肠液中对核苷降解能力的测定

人工肠液配制与1.3.6一致，再将阿拉伯半乳糖、胶质、木聚糖、土豆淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、粘蛋白、L-半胱氨酸添加至人工肠液中，至最终质量浓度为1、2、1、3、0.4、3、1、4、0.5 g/L，同时添加肌苷-鸟苷-腺苷至最终浓度分别为1.26 mmol/L[22]。离心2 mL菌体，将菌体重悬于750 μL含有核苷的人工饱腹肠液中，共培养于振荡培养箱(37 ℃、180 r/min)中60 min，终止反应后，以不加菌体的人工饱腹肠液作为空白对照，以添加菌体的人工饱腹肠液作为实验组，取20 μL上清液进行降解率测定，方法与1.3.1相同，计算如公式(6)所示：

(6)

式中：ρ空白，不加菌体人工肠液中各核苷的质量浓度；ρ实验，乳酸菌与含有核苷的人工肠液反应后各核苷的质量浓度。

1.3.8 数据处理与统计分析

实验所得数据均平行测3次，采用平均数±标准差的表示，采用Excel表格进行统计分析。

2 结果分析

2.1 高效降解核苷乳酸菌的筛选

以肌苷、鸟苷、腺苷3种核苷作为降解底物，采用HPLC法对海星等15种海洋动物肠道中分离得到的乳酸菌降解核苷的能力进行测定，结果见表1，从海星肠道中分离到的30株乳酸菌对3种核苷均表现出不同程度的降解能力，其中菌株L3、2Y-15与BX-59对3种核苷的降解率均在50%以上，表现出高效的核苷降解能力。在流动相为V(纯水)∶V(色谱级甲醇)=90∶10条件下，3种核苷能较好地分离，且峰形尖锐，无拖尾。肌苷、鸟苷、腺苷出峰时间为7.631、8.47、19.097 min(图1-a)，而菌株2Y-15与BX-59与核苷缓冲液共培养60 min后经相同液相条件测定，均未在7.631、8.47、19.097 min出现核苷特征峰(图1-b、图1-c)，说明菌体与核苷缓冲液共培养后降解了核苷底物，而且除BX-59对鸟苷的降解率为99.84%外，2株菌株对3种核苷降解率均达到100%。牛春华等[23]筛选到已在动物实验上证实其具有降尿酸效果的植物乳杆菌，其在60 min下对肌苷与鸟苷的降解率分别为57%与60%。本研究筛选的菌株2Y-15与BX-59与陈沈梁等[24]筛选获得的短乳杆菌对肌苷、鸟苷的降解率较相近，分别为98.07%、96.10%。目前报道的降解核苷酸的乳酸菌主要是针对肌苷和鸟苷这2种核苷，而菌株2Y-15与BX-59同时对肌苷、鸟苷、腺苷3种核苷均具有较高的降解率。利用乳酸菌预防或辅助治疗高尿酸血症主要是通过降解肠道中的核苷，金方等[18]认为干酪乳杆菌通过降解核苷、核苷酸，减少肠道对核苷、核苷酸的吸收，从而降低大鼠的尿酸。KANO等[25]也发现格氏乳杆菌PA-3可以减少肠道对核苷、核苷酸的吸收，达到降低尿酸的效果。因此，乳酸菌能否有效降解肠道中的核苷，是利用乳酸菌预防或辅助治疗高尿酸血症的关键。

表1 分离菌株对核苷的降解率 单位：%

a-空白组；b-菌株BX-59；c-菌株ZY-15图1 候选菌株降解核苷液相图Fig.1 The liquid phase diagram of nucleoside degradation by candidate strains

2.2 菌株鉴定

菌株2Y-15与BX-59的序列碱基长度分别为1 475与1 478 bp，两菌株的16S rDNA序列比对相似性为98%，在EZbiocloud数据库中对2株乳酸菌的16S rDNA基因序列与已报道的标准菌进行相似性比对，相似性最高的模式菌株均为LimosilactobacillusfermentumCECT562，相似率均为98.78%，而菌株2Y-15、菌株BX-59与相似性第2的Limosilactobacillusgorillae相似性分别为97.21%、97.01%。从EZbiocloud数据库收集相似性高的不同种属菌株的16S rDNA序列，并与菌株BX-59、2Y-15的16S rDNA一起使用MEGA软件构建系统发育树，从图2可知，菌株2Y-15、菌株BX-59与LimosilactobacillusfermentumCECT562位于同一簇群，结合相似率鉴定菌株2Y-15与BX-59均为发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)。

图2 两株乳酸菌的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of 2 strains of lactic acid bacteria

2.3 菌株的溶血活性

利用血平板实验对2株具有降解核苷的乳酸菌进行溶血性评价，从图3可知，2个血平板上的金黄色葡萄球菌ATCC 6538阳性对照组均出现了明显的溶血圈，而点种在血平板上的菌株BX-59与2Y-15均未出现溶血圈，表明这2株乳酸菌不具有溶血毒性。溶血性细菌对人体具有严重的危害，联合国粮农组织对应用于食品中的益生菌明确要求不能有溶血毒性[26]。大多数的乳酸菌不具有溶血性，但ARGYRI[27]从发酵橄榄中分离出73株乳酸菌，并发现4株戊糖乳杆菌具有α-溶血性，因此，溶血性也成为体外筛选对人体无害益生菌的必要检测指标。

a-左侧为金黄色葡萄球菌，右侧为菌株BX-59； b-左侧为金黄色葡萄球菌，右侧为菌株2Y-15图3 菌株BX-59与2Y-15的溶血活性Fig.3 Hemolytic activity of strains BX-59 and 2Y-15

2.4 菌株的抗生素敏感性

联合国粮农组织要求作为益生菌应不具有可转移的耐药性[26]，但目前，已有报道从保健食品益生菌制剂中分离到具有耐药性的乳酸菌，这些乳酸菌可能将携带的耐药基因转移到肠道的致病菌中，致使病菌出现耐药性，对人体健康造成严重的危害[28]。因此，乳酸菌的耐药性带来的安全问题也引起人们的关注[29]。目前，评估菌株抗生素敏感性的有效方法是采用MIC[20]，本研究对7种抗生素敏感性进行了评价，发现2株菌除对卡那霉素及菌株2Y-15对链霉素的MIC刚好达到欧洲食品安全局给出的指南临界值[20](64 μg/mL)外，对其他抗生素均低于临界值。虽然有报道认为有些乳酸菌对卡那霉素、链霉素等氨基糖苷类药物具有抗性，但不具有转移基因的特性[30]。而具有抗性的同时，是否具有转移基因的特性需要单独分析该种种内相关基因的进化情况和携带耐药基因的转移质粒的转移性，确保安全问题后续可进一步结合耐药基因检测、动物实验和临床试验进行验证。综合分析，本研究2株菌株具有一定的耐药性，2株降解核苷的发酵粘液乳杆菌具有益生菌产品开发及功能应用的潜力。

表2 菌株BX-59与2Y-15对7种抗生素的敏感性Table 2 Sensitivity of strains BX-59 and 2Y-15 to 7 antibiotics

2.5 菌株抗氧化活性测定

有研究发现，血尿酸浓度的过度升高，会导致机体氧化应激损伤，从而导致体内的抗氧化能力降低[31-32]。因此，降尿酸同时具备抗氧化作用已成为目前药物筛选的另一个热点。在本实验中，通过对2株具有降解核苷的发酵粘液乳杆菌抗氧化特性的测定，发现菌株BX-59与2Y-15对DPPH自由基与·OH均具有良好的清除能力(图4)，其中对DPPH自由基的清除率分别为61.05%和58.36%，对·OH的清除率分别为57.84%和61.12%，推测具有降尿酸功能的2株乳杆菌对高尿酸造成的氧化损伤具有潜在的抗氧化保护益生作用。

图4 菌株BX-59与2Y-15体外抗氧化能力Fig.4 Antioxidant capacity of strains BX-59 and 2Y-15 in vitro

2.6 菌株在人工胃肠液的存活率

乳酸菌经口服后，先需要抵抗3 h胃酸和胃蛋白酶的作用，随后乳酸菌与食物经胃部排空后进入肠道，再继续耐受肠道中胆盐和消化酶的胁迫，存活下来的才能有效定植于肠道，并发挥其益生功能。本研究从海洋动物肠道中分离出的2株具有降解核苷的乳酸菌在人工胃肠液模拟环境存活情况进行了评价。从图5可以看出，菌株BX-59与菌株2Y-15经过3 h的人工胃液作用后均表现出较强的存活能力，通过活菌数和公式(4)得出存活率分别为98.7%与99.8%，表明乳酸菌在人工胃液中有较强的耐受性。经过3 h人工胃液培养后，再转运至人工肠液培养4 h，存活率均出现了下降，菌株BX-59与2Y-15下降率分别为20%与36%，说明肠道中的胆盐和消化酶对2株菌存活率影响显著(P<0.05)，但活菌数均在1×105CFU/mL以上。HSIEH等[33]在酿酒副产物中分离出可降解核苷的乳酸菌，对胃液中的低酸环境和肠道中的胆盐环境有相似的耐受力。肖源勋等[34]从传统泡菜中分离筛选出具有降解60%肌苷和降解50%鸟苷的酪乳杆菌，经过测定后，发现酪乳杆菌可耐受胃蛋白酶、pH 3的低酸环境、胆盐和胰蛋白酶环境，并且对其进行动物实验验证其具有降尿酸功能。益生菌能够在胃酸、胃蛋白酶的胃部环境和胆盐、胰酶的肠道环境胁迫下存活，才能够发挥其对宿主的益生特性，因此益生菌的筛选需在体外模拟胃肠液环境转运后具有高存活率显得尤为重要[35]。

图5 人工模拟胃肠转运条件下菌株BX-59 与2Y-15的耐受性Fig.5 The tolerance of strains BX-59 and 2Y-15 in simulated gastrointestinal transport conditions

2.7 菌株在饱腹人工肠液中对核苷的降解能力

核苷是由食物中的核蛋白经过各种酶的作用转化来的，肠道对核苷有较强的吸收能力，并转化为尿酸导致高尿酸症。而乳酸菌经口服后，最终定植于肠道中，可以降低肠道对核苷的吸收[36]。本研究通过模拟人体进食后的饱腹状态，探究2株乳酸菌在饱腹人工肠液中对核苷的降解能力。从表3可知，2株菌对3种核苷均有不同程度的降解，其中菌株2Y-15在模拟人工饱腹肠液降解率明显优于菌株BX-59，并对肌苷与腺苷的降解率为100%，对鸟苷也达到了98.60%。虽然菌株2Y-15在人工胃肠液模拟环境存活率仅为64%，但存活下来的菌依然能有效地降解3种核苷。而菌株BX-59在人工胃肠液模拟环境存活率达到了80%，但对肌苷、鸟苷、腺苷降解率仅有60.78%、51.34%与59.00%，与XIAO等[16]筛选出的具有降尿酸乳酸菌在核苷缓冲液环境中对肌苷、鸟苷降解率相近(60%左右)，发酵粘液乳杆菌2Y-15在饱腹肠液环境中较菌株BX-59表现出更优秀的核苷降解能力，肠液的胆盐环境导致活菌数减少，在应用方面可以通过加大活菌数保证其短时间降解核苷的功能性。

表3 饱腹肠液条件下菌株BX-59与2Y-15 对核苷的降解率 单位：%

3 结论

本研究从海洋动物肠道中分离到菌株BX-59与2Y-15，经鉴定均为发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)，且2株菌株均无溶血性、对氯霉素、红霉素、氨苄等抗生素敏感，同时具备良好的抗氧化活性以及较好的耐受人工胃肠液环境能力，并且在饱腹的人工肠液中，保持着较高的核苷降解率，具有开发成益生菌制剂的潜能。本研究对具有降解核苷功能的2株乳酸菌进行了益生特性和体外安全性的评价，但其在复杂肠道环境中是否发挥其潜在的降尿酸功能和对机体的安全性还需进行动物实验验证。目前研究中，乳酸菌在人体肠道中定植后可减少肠道吸收过多核苷以减少血液中尿酸水平，所以本研究中所分离筛选的2株乳酸菌具有用于开发高尿酸血症防治微生态菌剂的潜能。