探究KCl代替NaCl对嗜酸乳杆菌和大肠杆菌的影响
2022-06-15王曦王楚南刘菊英张琴
王曦，王楚南，刘菊英，张琴*
1(中南大学湘雅医院 营养科，湖南 长沙，410000)2(昆明理工大学 津桥学院，云南 昆明，650000)
NaCl是最重要的食品添加剂之一，不仅能增强食物的质地和风味，还具有防腐作用。过量摄入NaCl可能导致高血压，是心血管疾病、中风和肾脏疾病的危险因素；同时增加肥胖及胃癌的发病风险[1]。因此，有必要使用代盐以减少钠盐的摄入。由于KCl与NaCl的理化性质相似,在既往研究中常作为NaCl的理想替代品。GAN等[2]报道在腊肉加工过程中KCl部分替代NaCl可促进乳酸杆菌的生长，有利于生产过程中的蛋白质水解和脂质氧化；KAMLEH等[3]证实KCl部分替代NaCl(30%)对Akkawi奶酪处理后，微生物随储藏时间增加而增长，但与NaCl处理并无显著性差异。
嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)是一种常见的益生菌，在食品工业中广泛应用，是生产面包、酸奶、奶酪等发酵食品的主要菌种[4]。L.acidophilus能提高食品的保鲜质量、风味和营养价值，与食品质量密切相关[5]。大肠杆菌(Escherichiacoli)是肠道中最主要的细菌，是一种条件致病菌。某些血清型如E.coliO157:H7是高致病性的，可污染饮用水、奶制品、生鲜等，导致人群水样腹泻和呕吐[6]。在食品工业中，必须严格控制E.coli数量低于国际安全标准，以确保食品质量和安全。因此，探究一种在不显著影响L.acidophilus的情况下能有效抑制E.coli生长的代盐至关重要。
增加盐浓度使渗透压达到临界值，革兰氏阳性菌细胞质膜分离受到影响[7]。另一研究显示当NaCl质量分数从5%增至10%时，革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的细胞形态受到影响[8]。质膜分离的突然发生会导致营养物质吸收和脱氧核糖核酸复制受到抑制，并引发细胞三磷酸腺苷水平的增加，从而导致大分子生物合成受到抑制[9]。因此，检测并找到合适的总盐浓度非常重要。当NaCl质量分数从3%增至7%时，微生物磷酸己糖异构酶、异柠檬酸脱氢酶和醛缩酶受到抑制[8]。当NaCl质量分数从0增至5%时，细胞活力和酯酶活性降低[10]。因此本研究选择总盐浓度为6%的条件下对细菌细胞的影响。
研究表明，乳制品中不同的盐浓度会影响细菌的细胞结构进而抑制细菌的生长和降低活性[11-13]。因此，本文将研究NaCl与KCl在总盐质量分数(6%)下的替代效果，并寻找一个不影响益生菌生长又能抑制致病菌生长的浓度组合，为KCl替代NaCl的适宜浓度提供依据。
1 材料与方法
1.1 主要材料与仪器
LactobacillusacidophilusCSCC 2400、EscherichiacoliATCC 2592，香港大学乳品和益生菌实验室提供。
LB(Luria-Bertani)培养基和MRS(deMann Rogosa Sharpe)培养基，美国Becton Dickinson公司。
BD-FACS-Aria III流式细胞仪，美国Becton Dickinson公司；FT-IR-8400S傅立叶变换红外光谱仪，美国Bruker公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细菌培养与盐干预
无菌MRS和LB培养基中分别接种L.acidophilus和E.coli，获得约108CFU/mL的初始浓度。稀释L.acidophilus和E.coli悬液至OD值为0.6～0.7。再将细胞置于室温(18～20 ℃)的不同盐溶液中：A(0% NaCl和0% KCl)、B(6% NaCl和0% KCl)、C(3% NaCl和3% KCl)、D(0% NaCl和6% KCl)。为了观察上述NaCl和KCl干预后细胞的变化，在1 h、3、5和7 d等时间点进行监测。为了长期维持细胞生长，在细胞悬浮液中加入乳糖(最终体积的2%)以提供足够的营养。
1.2.2 细菌活菌数检测
用平板计数法计算不同盐干预对活菌数的影响。细胞悬液在不同盐干预1 h、3、5和7 d后，用0.15%无菌蛋白胨水连续稀释细胞(10-1～10-7)，将0.1 mLL.acidophilus和E.coli细胞悬液分别涂在MRS和LB琼脂平板上。培养皿37 ℃孵育48 h，计数CFU，3次重复。
1.2.3 细胞膜完整性和酯酶活性检测——流式细胞术(flow cytometry，FCM)
将盐干预细胞(950 μL)与50 μL羧荧光素二乙酸酯(carboxyfluorescein diacetate，cFDA)在37 ℃水浴中孵育10 min，使cFDA在细胞内酶促转化为羧荧光素(carboxyfluorescein，cF)。去除多余cFDA，并向细胞中添加30 μL 碘化丙二钠(propylene sodium iodide，PI)。细胞在冰浴中孵育10 min，以标记细胞膜受损。通过热杀死细胞(100 ℃水浴1 h)和活细胞调整正确的参数，并进行染色[14-15]，cF染色细胞在488 nm激光激发后在530 nm处发出绿色荧光，PI染色细胞在635 nm处发出红色荧光[16]，数据采用FlowJo 7.6.2版(TreeStar Inc，美国阿什兰州)分析，根据它们的荧光性能将4个细菌群分为4个象限。用公式(1)计算了不同盐干预对细胞酯酶活性的影响。在Q3象限(四方图右下)，仅用cF染色的细胞被认为是监测盐干预后细胞内残留的酯酶活性。Q3是盐干预后细胞Q3象限的百分比，Q3控制是盐干预前细胞Q3象限的百分比。
(1)
1.2.4 细胞结构改变检测——傅立叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectrum，FT-IR)
稀释L.acidophilus和E.coli悬液至OD值分别为1.7和1.5左右。离心(4 000×g，4 ℃，10 min)收集盐干预细胞并在无菌生理盐水中通过再悬浮洗涤2次，离心(4 000×g，4 ℃，10 min)回收。将洗涤后的细胞悬浮在无菌蒸馏水中(100 mg湿细胞/mL)，取50 μL细胞悬液置于CaF2光学板上，在50 ℃的烘箱中干燥30 min。采用傅立叶变换红外光谱仪进行扫描，平均扫描20次，扫描范围为4 000～1 000 cm-1，分辨率为4 cm-1。对光谱进行变换(使用SavitzkyGolay算法进行基线校正、平滑和归一化)，并在阈值0.50%以上检测到峰值。为了校正背景，在每个样本之前记录空气光谱[17]。
1.2.5 统计学分析
实验结果用平均数±标准差表示，用SPSS 20.0统计软件采用单因素方差分析进行多组间比较；双侧P<0.05表示差异具有统计学意义。采用Tukey事后检验比较不同盐浓度下均值之间的差异。
2 结果与分析
2.1 菌数测定分析
活菌计数结果显示(图1)，在4个时间点，L.acidophilus经A盐干预的活菌量均大于B、C、D盐干预，且B的数量最少，提示B盐干预的抑制作用最大，C盐干预值
2.2 细胞膜完整性和酯酶活性测定分析
菌落形成数不能反映盐处理引起的细胞损伤程度和代谢活动的详细情况，因此，本研究应用FCM进一步检测，根据其结构或生理参数找到不同的亚群，以更好地了解细胞状态。L.acidophilus盐干预1 h结果如图2-a所示：B盐干预1 h的Q1象限的细胞数量(2.58%)在4个盐干预中最多，表明B盐干预的细胞死亡率最大，对L.acidophilus的生长有显著的抑制作用。盐干预1 h，从B盐到D盐，大部分细胞位于Q3象限且Q3象限的细胞数量增加，分别为73.0%、73.2%、79.4%，表明随KCl浓度增加对L.acidophilus的抑制作用减弱；在3、5和7 d的试验中，B、C和D盐干预的Q3象限的结果类似。
LA-L.acidophilus；A-0% NaCl，0% KCl；B-6% NaCl，0% KCl；C-3% NaCl，3% KCl；D-0% NaCl，6% KCl(下同) a-1 h；b-3 d；c-5 d；d-7 d图1 不同浓度的盐干预不同时长对L.acidophilus和E.coli活菌数的影响Fig.1 The impact of salt treatment after different treatment time on cell viability of L.acidophilus and E.coli 注：*表示在P<0.05水平差异显著；n=3(下同)
a-L.acidophilus 1 h盐干预；b-E.coli 1 h盐干预图2 cF与PI染色经盐干预1 h后对L.acidophilus和E.coli酯酶活性和膜完整性的流式点图分析Fig.2 FCM dot plot of cF vs PI salt treatment after 1 h on esterase activity and membrane integrity of L.acidophilus and E.coli.
E.coli盐干预1 h结果如图2-b所示，B盐干预1 h的Q1象限的细胞数量(15.2%)在4种不同盐干预中最多，表明B盐干预的细胞死亡率最大，对E.coli的生长有显著抑制作用。盐干预1 h，从B盐到D盐，Q3象限的细胞数量减少，分别为17.1%、16.5%和16.0%，表明随KCl浓度增加对E.coli的抑制作用增强。在3 d的试验中观察到相同的结果，而在5和7 d的试验中，B、C和D盐处理的Q1象限的结果相似。此外，发现盐干预1 h，大部分细胞位于Q2象限，而其他3个时间点大部分细胞位于Q4象限，即未染色细胞。
根据FCM点图计算和分析酯酶活性的数据如图3所示，L.acidophilus酯酶活性在不同盐浓度下随时间逐渐降低。在4个时间点，B盐干预对酯酶活性的影响最为明显，C盐干预效果次之，D盐干预效果最小。盐干预1 h，B(90.58%)、C(92.41%)盐干预组的酯酶活性均与A组有显著性差异(P<0.05)，但D(96.78%)盐干预组的酯酶活性与A组差异无统计学意义(P>0.05)。盐干预3、5和7 d，B、C、D盐干预组的酯酶活性均与A组有显著性差异(P<0.05)。
E.coli酯酶活性也在不同盐浓度下随时间逐渐降低。如图3所示，不同盐浓度干预1 h后，酯酶活性明显下降至60%以下，但在3、5和7 d的实验中，酯酶活性急剧上升至80%以上，可能与E.coli逐渐对各种盐干预适应，细胞膜不同程度地得到修复相关，其酯酶活性也不同程度的提高。结果表明，盐干预1 h，不同浓度的盐均能显著降低酯酶活性，与A盐干预有显著性差异(P<0.05)，其余3个时间点，仅D盐干预组对酯酶活性的抑制作用最大，与A盐干预有显著性差异(P<0.05)。
2.3 FT-IR分析
FT-IR被证明在研究细菌应激反应和微生物代谢方面有重要意义，细菌的主要细胞构件(蛋白质、脂类、多糖及其衍生物及其组合)的特征被记录。L.acidophilus和E.coli的FT-IR结果观察到不同峰的波长(阈值为0.5%)，如表1和表2所示。
表1显示L.acidophilus观察到不同波峰：不同浓度盐干预1 h，L.acidophilus的所有峰均能被检测到。其他3个不同时间点，仅在B盐干预组的第3天检测到1 377 cm-1的波峰，这与细胞壁蛋白中CH2的C—H弯曲模式有关，而其他L.acidophilus样品中则完全缺失，表明细胞壁蛋白中CH2的结构受损。1 551 cm-1处的峰值代表酰胺II区蛋白质中较大的CH2变形，盐干预第5天、第7天该峰值缺失，表明长时间的盐干预影响L.acidophilus细胞壁蛋白和肽，导致细胞结构受损。3 302 cm-1处的峰值代表酰胺-A的N—H拉伸模式。这个峰值在第5天及第7天未检测到，表明细胞壁蛋白酰胺-A受损，提示随着盐干预时间延长，细胞结构受损加重。2 958～2 854 cm-1峰值区域代表脂肪酸区域，盐干预实验的4个时间点都能检测到该区域的所有峰值，波数没有明显的变化。脂肪酸区域与膜流动性有关，表明不同的盐溶液对L.acidophilus细胞膜流动性没有影响。此外，代表酰胺I和酰胺II区，在1 539、1 647 cm-1的波峰在L.acidophilus所有标本中有位移；代表酰胺-A区波长为3 292 cm-1，在所有L.acidophilus样品中也有位移。综上，表明L.acidophilus细胞壁蛋白和肽对盐溶液敏感，但细胞膜流动性对盐浓度的变化具有稳定性。
表2显示E.coli观察到不同波峰：实验干预的第3天，C和D盐干预的E.coli均未出现1 551 cm-1的峰值，而在第5天和第7天，B、C和D盐干预的E.coli该峰值完全缺失，表明E.coli的细胞壁蛋白和肽结构受损。3 089 cm-1的吸收带主要是不饱和碳的C—H伸缩振动，其波峰值在1 h的C盐及3 d的A盐和C盐干预的E.coli中未检测到，在5及7 d盐干预中均未检测到。不同盐干预的4个时间点均能观察到代表酰胺A的N—H拉伸模式(3 290 cm-1)和脂肪酸区域(2 854、2 873、2 925、2 959 cm-1)的峰值，波数无明显变化。1 235 cm-1处的峰值代表酰胺III区的β-片层，C盐干预1 h观察到波峰值移至1 231 cm-1，且在第5天和第7天C盐和D盐干预中分别检测到波峰值向1 234、1 233 cm-1移动，表明E.coli从β-片层到不规则结构的变化，表明E.coli细胞壁蛋白质和肽可能受到影响。
3 讨论
活菌计数结果显示B盐干预对L.acidophilus抑制作用最显著，C盐干预对E.coli抑制作用最显著。图1可观察到E.coli在盐干预的第3天、第5天和第7天的活菌量急剧增加，并且都大于1 h。推测盐干预早期E.coli处于应激状态，活菌量减少，随着盐干预时间延长，E.coli适应性提高并以完整或最小受损的代谢能力迅速生长[18-19]。综合L.acidophilus和E.coli的活菌计数结果，C盐干预(3% NaCl，3% KCl)对E.coli生长抑制作用最显著，对L.acidophilus生长的抑制作用弱，是理想盐组合。FCM结果如图2、3所示，可观察到D盐干预对L.acidophilus细胞膜完整性和酶活力的损伤最小；而对E.coli损伤最大，表明D盐干预(6% KCl，0% NaCl)是L.acidophilus和E.coli理想盐组合。FT-IR常用于研究细胞结构变化，记录分子的官能团波数。4 000～3 100 cm-1的区域代表了广泛的构象特征，3 300 cm-1的条带归于酰胺A族的N—H拉伸模式[17,20]。3 100～2 800 cm-1的波数代表烷基烃和脂肪酸区域，其主要有—CH3、>CH2和>CH，通常存在于各种膜亲脂成分上的官能团的拉伸振动[21]。1 800～1 500 cm-1的区域是酰胺区，主要由细胞壁蛋白质和肽的酰胺Ⅰ(1 700～1 600 cm-1)和酰胺Ⅱ(1 550～1 453 cm-1)条带控制[22-23]。1 500～1 200 cm-1的区域代表混合区域，即包含蛋白质、脂肪酸和磷酸盐携带化合物信息的光谱区域[23]。1 330～1 295 cm-1代表蛋白质二级结构α-螺旋；1 295～1 270 cm-1代表β-转角；1 270～1 250 cm-1代表无规卷曲；1 245～1 220 cm-1代表β-片层；1 245～1 250 cm-1的边界区域可能同时具有无规卷曲和β-片层结构；1 300～1 295 cm-1的边界区域可能同时来自α-螺旋和β-转角结构[24]。该实验结果显示L.acidophilus细胞壁蛋白和肽对盐溶液敏感，但细胞膜流动性对盐浓度的变化具有稳定性。E.coli在C盐干预1 h后，3 089 cm-1的波峰值缺失，而B和D盐干预E.coli的结果无影响，表明C盐干预早期影响E.coli结构；同时1 235 cm-1处的峰值在C盐干预1 h后移至1 231 cm-1，而在D盐干预的第5天和第7天移至1 234、1 233 cm-1，表明C盐和D盐可破坏E.coli细胞壁蛋白的二级结构，与D盐比较，C盐对E.coli细胞壁蛋白结构的破坏出现的更早，更明显。综合L.acidophilus和E.coli的FT-IR结果，发现C盐干预(3% KCl，3% NaCl)是L.acidophilus和E.coli理想盐组合。
4 结论
活菌计数和FT-IR光谱分析的结果表明在终盐质量分数为6%时，3% KCl、3% NaCl的盐组合与6% NaCl相比可显著抑制E.coli而不显著影响L.acidophilus，是替代钠盐的理想盐组合；而FCM的结果显示6% KCl、0% NaCl是替代钠盐的理想盐组合。实际应用中钾盐替代钠盐能降低血压，但用钾盐替代100%钠盐会使肾功能不全或使用保钾利尿药的人群出现高钾血症，从而导致心律失常和猝死。因此，为避免高钾血症及其他并发症的出现，不推荐采用钾盐替代100%钠盐。综合考虑，用KCl替代50% NaCl即3% KCl、3% NaCl的盐组合是替代钠盐的理想盐组合，对一般人而言是安全的、有益的。本研究为探究理想代盐浓度组合以减少钠盐摄入，同时保障食品微生物安全，提供了实验数据，但钾盐替代钠盐在食品安全与生产中的应用有待进一步研究。
