Liguzinediol 调控心肌细胞线粒体动力学和自噬改善心肌梗死后大鼠心功能的机制

刘子勤，李文文，吴敬珍，童 静，张晨妍，祝伟杰，刘博文，王 浩，李 育*，齐 栩

1南京中医药大学医学院·整合医学学院，2药学院，江苏 南京 210023；3西安国际医学中心医院心脏内科，陕西 西安 710100；4南京医科大学第一附属医院呼吸与危重症医学科，江苏 南京 210029

心肌梗死后心肌能量代谢紊乱并会导致心力衰竭［1-4］。线粒体功能异常在各种类型衰竭的心脏中广泛存在，包括代谢底物利用率改变、线粒体氧化磷酸化受损、活性氧（reactive oxygen species，ROS）形成增加、线粒体膜电位去极化以及线粒体质控机制异常［5-6］。线粒体质控机制由线粒体动力学、线粒体生物合成、线粒体自噬3 个部分组成。在梗死后的心脏中，线粒体动力学紊乱，分裂增多，融合减少，导致线粒体碎片化、空泡化［7］。线粒体生物合成的减少及线粒体自噬过程的抑制会受导致线粒体清除受损，并促进心力衰竭的发生［8］。

线粒体结构受损和功能障碍导致三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）产生减少，能量供应不足促使心肌细胞凋亡导致心肌重塑［9-10］。同时损伤的线粒体释放过量的ROS 触发线粒体功能障碍和线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）打开，导致细胞死亡，加剧心肌梗死后心力衰竭发展［11］。因此线粒体的功能研究成为心肌梗死后心力衰竭的研究热点，靶向线粒体功能可能是潜在的有效治疗方法。

过去以川芎嗪作为先导化合物，设计并合成川芎嗪衍生物（liguzinediol，Lig），化学名为2，5⁃二羟甲基⁃3，6⁃二甲基吡嗪［12］。发现Lig 对正常及急、慢性心衰大鼠心脏均具有较强的正性肌力作用，且无心律失常等不良反应［12-16］。本研究通过左冠状动脉前降支结扎术构建心肌梗死后大鼠模型，围绕线粒体质控机制中动力学和自噬两个方面开展Lig对心肌梗死后大鼠心功能的影响和作用机制的研究，为后期临床中应用Lig减少心肌梗死后心力衰竭的发生提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

健康清洁级雄性SD 大鼠，7～8 周龄，体重270～300 g，69只，购自南京青龙山动物繁殖场，生产许可证号：SCXK（苏）2019⁃0002，实验动物使用许可证：SYXK（苏）2018⁃0049。饲喂全价营养颗粒饲料，自由采食及饮水。适应性饲养1周后进行实验。

Lig（南京中医药大学药学院李伟教授提供，批号：201801225，纯度：98.98%），地高辛（digoxin，Dig，批号：20190409，上海信谊药厂有限公司）；戊巴比妥钠（批号：20121123，Sigma 公司，美国）；线粒体裂变蛋白1（dynamin⁃related protein 1，DRP1）一抗（批号：AF，武汉Abclonal 公司），线粒体自噬受体蛋白FUNDC1（FUN14 domain containing 1）一抗（批号：08029531，上海Bioss公司），微管相关蛋白1A∕1B⁃轻链3B（LC3B∕MAP1LC3B）一抗（批号：10∕2016，Cell Signaling 公司，美国），缺氧诱导因子1α（hypoxia⁃in⁃ducible factor，HIF⁃1α）一抗（批号：ab463，Abcam 公司，美国），自噬选择性底物Sequestosome 1（P62∕SQSTM1）一抗（批号：20200424）、线粒体融合蛋白1（mitofusin1，MFN1）一抗（批号：20200512）、甘油醛⁃3⁃磷酸脱氢酶（glyceraldehyde⁃3⁃phosphate dehydro⁃genase，GAPDH）一抗（批号：20200521）、PTFN 诱导激酶1（PTFN induced putative kinase 1，PTNK1）一抗（批号：20200521）、F3 泛素⁃蛋白连接酶（ubiguitin⁃protein ligase F3，Parkin）一抗（批号：20200424）、Bcl2∕腺病毒F1B 相互作用蛋白3（BCL2∕adenovirus F1B 19 kDa protein⁃interaction protein 3，BNIP3）一抗（批号：20200101）（成都正能生物）。大鼠脑钠肽（brain natriuretic peptides，BNP）FLISA 检测试剂盒（批号：201912）、大鼠乳酸脱氢酶（lactate dehydroge⁃nase，LDH）FLISA 检测试剂盒（批号：201912）（武汉酶免公司）；大鼠胚胎心肌细胞（H9C2）（批号：20210706，南京凯基生物）；雷帕霉素（rapamycin，Rapa，批号：202111⁃1 mg）、3⁃MA（批号：202111⁃100 mg）（上海Dcchemical 公司）；TOROBlue®qRT Premix with gDNA Fraser2.0（批号：k2109221）、TO⁃ROGreen®qPCR Master Mix（批号：k2108181）（南通Toroivd公司）；Ad⁃mCherry⁃GFP⁃LC3B（批号：C3011⁃1 mL）、ROS检测试剂盒（批号：011570200504）、JC⁃1线粒体膜电位试剂盒（批号：08281900421）（杭州碧云天公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型复制、分组及给药

7～8 周龄、雄性SD 大鼠称重，1%戊巴比妥钠30 mg∕kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定四肢头部，四肢皮下连接心电图电极，监测心电图，气管插管连接小动物呼吸机（呼吸频率：90 次∕min，潮气量10～12 mL，呼吸比为1∶2）。左前胸备皮，碘伏消毒，于胸骨左侧第3～4肋间切开长约1 cm 切口，钝性分离肌肉、胸膜，用止血钳撑开第三肋间，放入扩创器固定切口以暴露手术视野，弯头镊轻轻撕开心包膜，使用6∕0 带线缝合针在左心耳下缘3～4 mm 进针，进针深约1.5 mm，斜向右上肺动脉圆锥方向出针，针距约3～4 mm，结扎左冠状动脉前降支，观察结扎后大鼠心电图J 点上移确认心肌梗死，随后逐层缝合切口。将造模后的大鼠随机分为模型组（生理盐水6 mL∕kg，n=10）、Dig 组（0.033 2 mg∕kg，n=10）、Lig组（Lig 5.0、10.0、20.0 mg∕kg，n=10）、假手术组（大鼠开胸但不结扎）。手术当天，开始灌胃给药，每日1次，持续12周。假手术组灌胃等体积生理盐水。本研究已通过南京中医药大学实验动物伦理委员会审查（201906A030）。

1.2.2 大鼠心功能检测

给药12周后，检测左心功能。每组取4只大鼠采用B 超检测射血分数（ejection fraction，FF）、左室短轴缩短率（fractional shortening，FS）、左心室舒张期容积（left ventricular volume in diastole，LVVOLd）、左心室收缩期容积（left ventricular volume in systole，LVVOLs）、左心室舒张期内径（left ventricular inter⁃nal diameter in diastole，LVIDd）、左心室收缩期内径（left ventricular internal diameter in systole，LVIDs）等。检测结束后颈总动脉取血，静置后离心取上层血清-80 ℃保存备用。每组取6个血清样本，使用试剂盒对血清中BNP、LDH含量进行检测。

1.2.3 检测大鼠心肌组织中ATP含量

每组取6 只大鼠的心脏样本，每个样本剪取50 mg，加入300 μL RIPA 裂解液（含1%PMSF）研磨裂解，4 ℃3 000 r∕min 离心取上清，按照试剂盒说明书步骤进行加样，操作结束后放入酶标仪中检测638 nm 处吸光度值，再用BCA 法检测蛋白浓度，按照说明书计算公式代入数值计算样品中ATP 含量。

1.2.4 大鼠心肌电镜检测、HF 染色、免疫组织化学染色

颈动脉取血后摘取大鼠心脏，生理盐水灌洗，横向切取心尖部3 mm 厚组织，用2.5%戊二醛固定后电镜检测线粒体形态（放大倍数×10 000），横向切取结扎点水平3 mm 厚组织，用4%多聚甲醛固定后制作石蜡切片。剩余心脏于-80 ℃和4%多聚甲醛中保存备用。

HF 染色：石蜡切片脱蜡至水，苏木素染色4 min，自来水洗2 min；1%盐酸酒精分化20 s（镜下控制），自来水洗15 min，蒸馏水洗1 min；伊红染色6 min，自来水洗5 min；脱水透明后中性树脂封片，显微镜400倍观察、拍照。

免疫组织化学染色：石蜡切片脱蜡至水，抗原修复处理后用5%BSA 孵育20 min；分别与一抗（PINK1、Parkin、BNIP3、FUNDC1）4 ℃孵育过夜；37 ℃复温，用PBS 漂洗3 次后与二抗37 ℃孵育1 h。PBS 漂洗后用DAB 染色，苏木素对细胞核进行染色，脱水透明封片后镜下拍照。

1.2.5 Western blot检测心肌组织和H9C2细胞自噬和动力学相关蛋白表达

剪取左心室组织50 mg，加入500 μL RIPA裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1），于冰浴中用电动匀浆器充分破碎裂解组织后离心（4 ℃、12 000g、15 min），收集上清。细胞给药处理后，消化收集细胞，每皿细胞加入80 μL RIPA裂解液，充分吹打使细胞裂解，离心取上清。BCA法检测蛋白浓度，按上样缓冲液∶蛋白上清=1∶4 加入5×上样缓冲液，沸水浴煮15 min，冷却后-20 ℃保存备用。配制12%分离胶，按30 μg上样量进行上样，同时加入5 μL 蛋白Marker，于恒压80～100 V 电泳。PVDF 膜浸于甲醇活化15 s，于低温环境下转膜。转膜条件：恒压100 V，1.5 h。转膜完成后，用5%脱脂奶粉溶液封闭2 h，经TBST充分洗涤后（5 min∕次、5 次），与相应目的蛋白（MFN1、DRP1、FUNDC1、LC3Ⅰ∕Ⅱ、P62、GAPDH抗体）结合，4 ℃过夜。TBST充分洗涤后（5 min∕次、5次），与相应二抗室温结合2 h，TBST 充分漂洗（5 min∕次、5 次），滴加FCL发光液，于成像系统中曝光。

1.2.6 氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation，OGD）模型构建、分组及给药

为模拟心肌缺血状态，选用OGD模型。使用氯化钴诱导缺氧，MTT法检测不同浓度氯化钴和Lig对H9C2细胞活力的影响，与对照组相比，培养24 h后H9C2细胞存活率50%的氯化钴浓度为600 μmol∕L，依据前期实验，选择Lig 最高浓度为100 μmol∕L［16］，此时细胞存活率为100%；MTT法检测600 μmol∕L氯化钴+无糖培养基在不同时间点对H9C2 细胞活力的影响，与对照组相比，培养12 h后H9C2细胞存活率为50%；因此选择600 μmol∕L 氯化钴+无糖培养基培养12 h复制H9C2细胞OGD模型。Western blot检测HIF⁃1α表达升高验证模型复制成功。细胞密度生长至80%左右给药，分为空白对照组、模型组、Lig（100 μmol∕L Lig）组、Lig+Rapa（100 μmol∕L Lig+20 μmol∕L Rapa）组、Lig+3⁃MA（100 μmol∕L Lig+10 mmol∕L 3⁃MA）组。提前加入Lig、Rapa、3⁃MA 预处理2 h，OGD处理12 h后收集细胞样本。

1.2.7 转染Ad⁃mCherry⁃GFP⁃LC3B 检测H9C2 细胞自噬溶酶体形成

细胞接种于底部放有12 mm 圆形玻片的24 孔板中，待细胞密度达到50%时进行转染，MOI值=10，每孔加入10 μL 转染试剂，轻轻晃动混匀后放入培养箱培养24 h 后更换培养液。待细胞密度生长至80%左右进行给药（方法同1.2.6）。

1.2.8 荧光探针检测H9C2细胞ROS水平

细胞接种于底部放有12 mm 圆形玻片的24 孔板中，待细胞密度生长至80%左右加入ROS荧光探针，孵育30 min。进行药物处理后镜下观察拍照（方法同1.2.6）。

1.2.9 TUNFL试剂盒检测细胞凋亡

细胞接种于底部放有12 mm 圆形玻片的24 孔板中，待细胞密度生长至80%左右给药。固定细胞后按试剂盒说明书进行处理（方法同1.2.6）。

1.2.10 JC⁃1线粒体膜电位试剂盒检测

细胞接种于底部放有12 mm 圆形玻片的24 孔板中，待细胞密度生长至80%左右加入JC⁃1荧光探针，孵育30 min后给药（方法同1.2.6）。

1.3 统计学方法

彩用SPSS 21.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（）表示，对多组数据进行单因素方差分析，重复测量数据进行重复测量方差分析，两两比较采用LSD⁃t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Lig对心肌梗死模型大鼠心功能的影响

超声心动图结果显示（图1），相较于假手术组，模型组大鼠的FF 和FS 均显著下降，表明心肌梗死模型大鼠的心脏功能显著降低。给予Dig和不同剂量的Lig 治疗的大鼠，相较于模型组，FF 和FS 明显升高，LVVOLs 和LVIDs 减小，超声结果显示Lig 可改善左室收缩功能从而改善心脏泵血。

图1 Lig对心肌梗死模型大鼠左心功能的影响Figure 1 Effects of Lig on left heart function in rats with myocardial infarction

2.2 Lig 对心肌梗死模型大鼠心肌损伤标志物的影响

可根据大鼠血清中BNP、LDH 含量判断心肌损伤的严重程度，通过FLISA试剂盒对BNP、LDH含量进行检测，分析结果发现模型组大鼠血清BNP、LDH水平较假手术组显著升高（图2）。与模型组相比，Dig组、Lig 10 mg∕kg和Lig 20 mg∕kg组可显著降低血清BNP、LDH水平，说明Lig可显著改善大鼠左冠状动脉前降支结扎所致的心脏损伤。

图2 Lig对心肌梗死模型大鼠血清BNP、LDH含量的影响Figure 2 Effects of Lig on serum BNP and LDH in rats with myocardial infarction

2.3 Lig对心肌梗死模型大鼠心肌组织中ATP含量的影响

通过试剂盒检测心肌组织中ATP 含量（图3），结果显示：与假手术组相比，模型组ATP 含量显著降低；与模型组相比，Lig（10 mg∕kg、20 mg∕kg）组ATP含量明显升高。

图3 Lig对心肌梗死模型大鼠心肌组织ATP含量的影响Figure 3 Effects of Lig on ATP content in myocardial tis⁃sue in rats with myocardial infarction

2.4 Lig 对心肌梗死模型大鼠心肌和线粒体形态的影响

HF 染色观察心肌形态，通过电镜进一步探寻心肌细胞中线粒体形态结构的变化，结果显示（图4）：光镜下，假手术组大鼠心肌排列紧密，未观察到心肌断裂、细胞间隙变大，模型组大鼠可见心肌断裂，细胞间隙增大，给予Dig 和不同剂量Lig 治疗组大鼠心肌断裂不同程度减少，间隙变窄。电镜下，假手术组大鼠心肌线粒体呈圆形和椭圆形，嵴结构致密，规律分布于肌原纤维之间，肌原纤维排列整齐连续，可见清晰的横纹，有自噬体形成；模型组大鼠心肌线粒体嵴结构疏松，排布紊乱，部分肌原纤维断裂；Dig组大鼠心肌线粒体嵴结构较致密，部分肌原纤维断裂；Lig 20 mg∕kg组大鼠心肌线粒体嵴结构致密，肌原纤维排列整齐且连续，间隙中线粒体密集分布，可见自噬溶酶体。

图4 Lig对心肌梗死模型大鼠心肌和线粒体形态的影响Figure 4 Effects of Lig on the morphology of myocardial and mitochondria in rats with myocardial infarction

2.5 Lig 对心肌梗死模型大鼠心肌组织中线粒体动力学和自噬相关蛋白表达的影响

Lig 可改善线粒体形态，因此借助Western blot观察心肌组织中与此相关的蛋白表达变化（图5）。结果显示与假手术组相比，模型组中MFN1 的表达减少，DRP1 的表达升高，说明线粒体处于分裂状态，导致线粒体的碎片化；Lig 组MFN1 表达水平相较于模型组显著升高，DRP1 表达降低，说明Lig 可以抑制线粒体分裂，促进功能正常的线粒体融合，从而维持线粒体的正常形态。

图5 Lig对心肌梗死模型大鼠心肌线粒体动力学和自噬相关蛋白表达的影响Figure 5 Effects of Lig on the expression of myocardial proteins associated with mitochondrial dynamics and autophagy in rats with myocardial infarction

与假手术组相比，模型组中LC3Ⅱ∕LC3Ⅰ的比值降低，P62的表达升高，表明模型组自噬流处于抑制状态；Lig组的LC3Ⅱ∕LC3Ⅰ比值相较于模型组显著升高，P62 表达降低，说明Lig 组自噬流未受到抑制，处于激活状态。

2.6 Lig 对心肌梗死模型大鼠心肌组织中线粒体自噬通路相关蛋白表达的影响

通过免疫组织化学染色观察心肌中线粒体自噬通路的4 个代表性蛋白的表达水平（图6）。与假手术组比较，模型组中线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、BNIP3 的表达显著降低，而FUNDC1 的表达与假手术组无显著差异；在给予Lig 治疗后，PINK1、FUNDC1 的表达显著上调，呈剂量依赖关系，Lig（20 mg∕kg）组Parkin 和BNIP3 的表达水平较模型组显著上升。Dig组与Lig（20 mg∕kg）组的作用类似。

图6 Lig对心肌梗死模型大鼠心肌线粒体自噬相关蛋白表达的影响Figure 6 Effects of Lig on the expression of myocardial proteins associated with mitophagy in rats with myocardial infarction

2.7 Lig 对OGD 模型H9C2 细胞线粒体动力学相关蛋白表达的影响

OGD处理细胞后，模型组HIF⁃1α表达水平较对照组显著升高，说明模型复制成功。与对照组相比，模型组（OGD 组）中MFN1 的表达减少，DRP1 的表达升高，LC3Ⅱ∕LC3Ⅰ的比值降低，P62 的表达升高；相较于OGD 组，Lig 处理的OGD+Lig 组MFN1 表达水平显著升高，DRP1表达降低。LC3Ⅱ∕LC3Ⅰ比值升高，P62表达降低（图7）。这些改变与在体组织中蛋白表达的变化相一致。

图7 Lig对OGD模型H9C2细胞线粒体动力学和自噬相关蛋白表达的影响Figure 7 Effects of Lig on the expression of myocardial proteins associated with mitochondrial dynamics and autophagy in rats with myocardial infarction

2.8 Lig 对OGD 模型H9C2 细胞线粒体自噬相关蛋白表达的影响

与对照组相比，模型组（OGD组）线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、BNIP3的表达水平显著降低，FUNDC1 的水平明显升高；相比于模型组，Lig 处理的OGD+Lig 组PINK1、Parkin、BNIP3 的表达水平明显上升，FUNDC1 的表达水平显著下降。OGD+Lig组自噬相关蛋白的表达总体高于OGD组（图8）。

图8 Lig对OGD模型H9C2细胞线粒体自噬相关蛋白表达水平的影响Figure 8 Effects of Lig on expression of mitophagy⁃associated proteins in H9C2 cells of OGD model

2.9 联用自噬激动剂和抑制剂观察Lig 对H9C2 细胞线粒体自噬溶酶体形成的影响

通过转染Ad⁃mCherry⁃GFP⁃LC3B 观察H9C2 细胞中自噬体与溶酶体融合的情况（图9）。结果发现模型组中自噬溶酶体的形成较对照组显著降低，给予Lig 或Lig+自噬激动剂Rapa 后，自噬溶酶体的形成均较模型组增加，而给予Lig+自噬抑制剂3⁃MA 组的自噬溶酶体形成则与模型组无显著差异。

图9 Lig及联用自噬激动剂或诱导剂对OGD模型H9C2细胞线粒体自噬溶酶体形成的影响Figure 9 Effects of Lig and its combination with autophagy agonist or inducer on the formation of mitochondrial autolyso⁃somes in H9C2 cardiomyocytes of OGD model

2.10 联用自噬激动剂或抑制剂观察Lig 对OGD 模型H9C2细胞线粒体膜电位的影响

荧光结果显示，相较于对照组，模型组线粒体膜电位显著降低。Lig组和联用Rapa组线粒体膜电位相较于模型组显著升高，而Lig+自噬抑制剂3⁃MA组线粒体膜电位相较于模型组无明显差异（图10）。在自噬抑制剂同时给药时，Lig 保护线粒体膜电位的作用被抑制。

图10 Lig及联用自噬激动剂和诱导剂对OGD模型H9C2细胞线粒体膜电位的影响Figure 10 Effects of Lig and its combination with autophagy agonist and inducer on mitochondrial membrane potential in H9C2 cardiomyocytes of OGD model

2.11 联用自噬激动剂或抑制剂观察Lig 对OGD 模型H9C2细胞ROS水平和细胞凋亡的影响

通过荧光标记来检测H9C2细胞的ROS水平和凋亡（图11），OGD模型组ROS荧光强度和细胞凋亡比例相较于空白对照组明显升高，而给予Lig 和同时给予Lig 和自噬激动剂Rapa 的两组，ROS 水平和细胞凋亡比例相比于模型组明显降低，同时给予Lig+自噬抑制剂3⁃MA 的组别，与模型组相比，ROS水平升高，而细胞凋亡率差异无统计学意义。以上实验结果说明Lig 可增加自噬体与溶酶体结合，促进受损线粒体的降解回收，减少ROS 的释放，保护线粒体膜电位，从而减少细胞凋亡。

图11 Lig及联用自噬激动剂或诱导剂对OGD模型H9C2细胞ROS水平和细胞凋亡的影响Figure 11 Effects of Lig and its combination with autophagy agonist or inducer on ROS level and apoptosis in H9C2 cardio⁃myocytes of OGD model

3 讨论

本研究使用大鼠心脏左冠状动脉前降支结扎术复制大鼠心肌梗死模型，结合体外H9C2 细胞OGD模型证实了Lig 可调控心肌细胞线粒体动力学和自噬，改善心肌梗死后大鼠的心功能。

在体研究使用心电图确认了大鼠心肌梗死模型是否复制成功，并通过心脏超声FF和FS指标，血清BNP 含量，HF 染色观察心肌病理形态，证实Lig可有效改善左冠状动脉前降支结扎导致的大鼠心肌收缩功能衰竭、减轻心肌损伤（图12）。

图12 Lig改善心肌梗死大鼠心功能的机制Figure 12 Mechanism of Lig on improving cardiac function in myocardial infarction rats

心脏持续的节律收缩舒张决定了心肌高耗能的特质，而线粒体的形态决定了其功能运转是否正常，完整致密的嵴结构是线粒体能量合成的重要基础。线粒体形态主要受线粒体动力学和自噬的影响。线粒体动力学包括线粒体裂变和融合两个部分，主要负责调节线粒体大小形态；线粒体自噬是对损伤线粒体的清除和回收过程，可减少受损线粒体的细胞色素C 和ROS 释放，有助于细胞内稳态，两者都是线粒体质控机制的重要环节，已有多项研究表明心肌梗死后线粒体功能异常在心力衰竭的发展过程中发挥着重要作用，调节线粒体功能可能是减少心肌梗死后心力衰竭发生的有效手段［17-20］。

通过电镜检测观察线粒体形态，同时检测心肌组织中ATP含量，判断线粒体能量合成情况，MFN1是线粒体外膜融合蛋白，DRP1 调节线粒体外膜分裂，检测两者表达水平了解线粒体融合分裂趋势；检测LC3Ⅱ∕LC3Ⅰ和P62 的表达水平评价自噬流，LC3Ⅱ∕LC3Ⅰ升高而P62 表达降低说明自噬流处于活化状态，而伴有P62 表达升高则表示自噬流受抑。对线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、BNIP3、FUNDC1的表达进行检测，结果显示Lig可活化自噬流，减少线粒体分裂，促进融合，明显改善心肌梗死大鼠的线粒体形态结构，促进ATP 合成，从而增强模型大鼠心脏收缩能力，改善心脏功能。

本研究进一步在细胞模型上验证Lig 与线粒体动力学和自噬之间的关系，复制OGD细胞模型模拟心脏的缺血缺氧损伤。用氯化钴诱导细胞缺氧，其能抑制脯氨酸羟基化酶（PHD）的活性，使HIF⁃1α蛋白稳定表达，可通过检测HIF⁃1α表达水平验证是否成功诱导缺氧［21］，并检测MFN、DRP1、LC3B、P62 以及线粒体自噬3 条主要途径相关蛋白（PINK1、Par⁃kin、BNIP3、NIX、FUNDC1）的表达水平。研究结果表明Lig 可能促进线粒体融合和自噬，抑制过度分裂，与动物模型一致。

线粒体损伤后膜电位降低，自噬的早期过程是相关蛋白激活引导的自噬双层膜结构形成包裹，损伤线粒体形成自噬体，后期过程则是自噬体与溶酶体结合降解，当损伤的线粒体不能及时清除，ROS过度释放则会导致细胞凋亡［22］。为了明确Lig是否通过激活自噬清除膜电位降低的损伤线粒体，减少ROS 和细胞凋亡，本研究利用自噬激动剂和抑制剂激活自噬或抑制自噬，通过转染Ad⁃mCherry⁃GFP⁃LC3B，观察H9C2细胞中自噬体与溶酶体融合情况，并通过荧光标记对线粒体膜电位、ROS 水平和细胞凋亡进行检测。研究结果证实Lig确实通过促进自噬过程清除受损的线粒体，减少ROS释放并维持线粒体保持较高的膜电位从而保护线粒体形态和功能，减少心肌细胞凋亡。

综上所述，Lig可能通过激活心肌细胞中被抑制的自噬和促进线粒体融合，改善线粒体形态和功能，减少心肌细胞凋亡，发挥改善心脏功能的作用。这些研究提示Lig可能是减少心肌梗死后心力衰竭发生的潜在有效药物。