兰索拉唑诱导心肌细胞氧化应激损伤的机制研究

钱徐萍，张学会，孙鲁宁，王 雨，孙诗钰，马梦圆，程紫萍，陈安九*，王永庆*

1徐州医科大学江苏省新药研究与临床药学重点实验室，江苏 徐州 221004；2南京医科大学第一附属医院药学部，江苏 南京 210029；3江苏盛泽医院药学部，江苏 苏州 215228

兰索拉唑（lansoprazole，LPZ）是二代质子泵抑制剂（proton pump inhibitor，PPI），主要通过抑制胃壁细胞的H+∕K+⁃ATP 酶系统来阻断胃酸分泌，以达到抑酸的效果［1］。临床广泛用于胃溃疡、十二指肠溃疡、反流性食管炎以及卓⁃艾综合征的治疗，也可与其他药物联合用于治疗幽门螺旋杆菌感染。随着LPZ在临床的广泛应用，特别是长期使用，其潜在的不良反应逐渐引起研究者的关注。短期使用LPZ常见的不良反应主要包括腹痛、便秘、腹泻、恶心、头晕或头痛等。长期或大剂量使用LPZ可能会导致骨质疏松、感染、肾脏损伤、维生素B12等微量元素缺乏，并增加心血管事件的发生风险［2-3］。研究表明，长期大剂量使用PPI可导致心动过快［4］，也有调查报告显示，163例PPI所致严重不良反应中，心血管系统不良反应有7例，占4.29%［5］。心血管事件主要包括心肌梗死、心力衰竭等，而心肌梗死的发生与细胞内钙超载、活性氧增加、心肌细胞凋亡和线粒体破坏等特定途径有关［6-7］。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一种引起氧化应激的过氧化物，可通过损伤细胞膜脂质及脱氧核糖核酸（deoxyribo nucleic acid，DNA）等机制损伤细胞［8］。ROS 已被证实可以引发内质网应激，从而参与细胞凋亡过程［9］。内质网应激是一种新的凋亡途径，参与各种状态下的细胞凋亡。当内质网处于应激状态时，内质网的分子伴侣如葡萄糖调节蛋白78（glucose⁃regulated protein 78，GRP78）会相应增加，GRP78 是内质网应激反应的标志蛋白，与错误折叠的蛋白或未折叠的蛋白相结合，使细胞进入降解途径［10］。内质网应激诱导的下游凋亡信号通路包括CCAAT∕增强子结合蛋白同源蛋白或生长停滞及DNA 损伤诱导基因153（CHOP∕GADD153）、c⁃Jun 氨基末端激酶（JNK）、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（cyste⁃inyl aspartate⁃specific proteinase，Caspase）通路。内环境处于稳态时，C∕FBP 同源蛋白（C∕FBP⁃homolo⁃gous protein，CHOP）和Caspase⁃12 的表达很弱，当稳态失衡时，细胞发生内质网应激，CHOP 和Cas⁃pase⁃12 的表达明显升高，过度表达的CHOP 和Caspase⁃12 会促使细胞周期停滞甚至导致细胞凋亡［10］。凋亡被认为是心肌损伤的重要潜在机制之一。因此，本研究以心肌细胞中ROS 为基础，运用Western blot、荧光显微等技术，探究LPZ 增加心血管风险的可能机制，为临床安全用药提供一定参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株H9C2（大鼠心肌细胞），购于中国科学院分子细胞科学卓越创新中心。

1.1.2 药品与试剂

兰索拉唑标准品（纯度99.6%，中国食品药品检定研究院）；DMFM培养基、胎牛血清、Trypsin⁃FDTA消化液（Biological Industries 公司，以色列）；二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）（Sigma 公司，美国）；GAPDH 抗体、GRP78 抗体、细胞色素C（cyto⁃chrome C，Cyt C）抗体、HRP标记山羊抗兔IgG（武汉塞维尔生物科技有限公司）；B细胞淋巴瘤∕白血病2（B⁃cell lymphoma∕leukemia 2，Bcl⁃2）抗体（Abcam 公司，英国）；Cleaved⁃Caspase⁃12 抗体、CHOP 抗体、Cleaved⁃Caspase⁃3抗体（CST公司，美国）；Bcl⁃2相关X蛋白（Bcl⁃2⁃associated X protein，Bax）抗体（Protein⁃tech 公司，美国）；β⁃actin 抗体（Affinity 公司，美国）；N⁃乙酰⁃L⁃半胱氨酸（N⁃acetyl⁃L⁃cysteine，NAC）、PMSF、RIPA 裂解液（杭州碧云天生物技术有限公司）。

1.1.3 主要仪器

CO2培养箱HF100（上海力申科学仪器有限公司），离心机（Fppendorf 公司，美国），倒置荧光显微镜IX73（Olympus 公司，日本），电泳仪PowerPacTMBASIC（Bio⁃Rad 公司，美国），超声破碎仪（Sonics 公司，美国），化学发光图像分析系统（Tanon 5200 Multi，上海天能科技有限公司），流式细胞分析仪（Beckman Coulter公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组

H9C2 贴壁生长，正常培养阶段使用含1%双抗和10%胎牛血清的DMFM 培养基进行培养，隔天换液。细胞给药阶段用含有0.1% DMSO、1%双抗和10%胎牛血清的培养基或相应的含药培养基进行培养，每天换液。细胞于37 ℃、含有5%CO2的培养箱中培养，当细胞密度长至80%左右时进行传代，传代比例为1∶3，取状态良好的对数生长期细胞进行实验。

第一阶段实验分为0 h组、12 h组、24 h组和48 h组，各组细胞间DMSO 含量、培养时间保持一致，LPZ 浓度为10 μmol∕L。第二阶段实验分为Con 组、LPZ 组、NAC 组、LPZ+NAC 组共4 组。Con 组为对照组；LPZ 组中含有10 μmol∕L LPZ；NAC 组中含有1 mmol∕L NAC；LPZ+NAC 组中含有1 mmol∕L NAC和10 μmol∕L LPZ，各组间DMSO 含量保持一致，共同培养48 h。

1.2.2 ROS荧光检测

对数生长期细胞以3×104个∕mL 接种至6 孔细胞培养板，每孔2 mL，置于37 ℃、含5%CO2的培养箱中培养24 h，细胞给药后培养一定时间，用10 μmol∕L DCFH⁃DA染液于37 ℃培养箱孵育20 min，用无血清培养基清洗3次，以488 nm为激发波长在荧光显微镜下进行观察。

1.2.3 Western blot法检测蛋白表达

对数生长期细胞以3×104个∕mL个接种至6孔细胞培养板，每孔2 mL，置于37 ℃、含有5%CO2的培养箱中培养24 h，细胞给药后培养一定时间，用RIPA裂解液（使用前2 min内加入蛋白酶抑制剂）冰上裂解细胞15 min，刮取的细胞裂解液用细胞破碎仪冰上超声3～5 次，每次5 s，然后离心取上清。根据BCA试剂盒操作说明测定蛋白浓度，调齐浓度后加入5×蛋白上样缓冲液煮沸10 min，变性后的蛋白样本立即使用或保存于-80 ℃冰箱。使用10%或12%的SDS⁃PAGF分离胶，按照每孔35 μg的上样量进行电泳，待蛋白分离后停止电泳。用湿转法转移至PVDF膜上，室温条件下用5%脱脂牛奶封闭90 min，经TBST漂洗后放入相应的一抗中，4 ℃孵育过夜。次日取出条带，用TBST缓冲液漂洗3次，每次10 min。室温条件下在摇床上孵育二抗约1 h，结束后仍用TBST 缓冲液漂洗3 次，最后使用Tanon 显色系统进行显影。用Image J 软件对Western blot 条带进行半定量分析，各给药组目的蛋白的表达用对照组进行标准化。

1.3 统计学方法

实验数据以均数±标准差（）的形式表示，所有数据均使用Graph Pad Prism 9 软件进行统计分析，多组间比较使用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。每项实验均独立重复3 次，使用Graph Pad Prism 9软件进行作图。

2 结果

2.1 LPZ时间依赖性地诱导氧化应激

为了研究LPZ 长期作用对H9C2中ROS 水平的影响，分别用10 μmol∕L LPZ 孵育细胞12、24、48 h后，采用ROS 检测试剂盒进行检测。结果如图1 所示，10 μmol∕L LPZ 孵育细胞48 h，ROS 荧光强度与对照组相比差异有统计学意义，LPZ 可以时间依赖性地诱导氧化应激。

图1 LPZ对H9C2细胞氧化应激的影响Figure 1 The effects of LPZ on oxidative stress in H9C2 cells

2.2 LPZ时间依赖性地诱导内质网应激，增加凋亡相关蛋白的表达

为了研究LPZ 对H9C2 细胞内质网应激和凋亡相关蛋白表达的影响，分别用LPZ孵育细胞12、24、48 h后，用Western blot进行检测。结果显示，LPZ可以时间依赖性地增加H9C2中内质网应激相关蛋白GRP78 和CHOP 的表达，且在48 h 时最为明显（图2）。Caspase⁃12 和Caspase⁃3 的激活在内质网应激诱导的细胞凋亡中起关键作用。LPZ时间依赖性地增加Cleaved⁃Caspase⁃12 和Cleaved⁃Caspase⁃3 蛋白的表达，且在给药24 h时蛋白表达与0 h比较，差异有统计学意义（图3），说明LPZ引发H9C2细胞内质网应激后触发凋亡。Bax凋亡蛋白表达呈时间依赖性增加，Bcl⁃2 抗凋亡蛋白表达呈时间依赖性降低，Cyt C蛋白表达呈时间依赖性增加，进一步说明LPZ时间依赖性地诱导细胞凋亡。

图2 LPZ对H9C2细胞内质网应激蛋白表达的影响Figure 2 The effects of LPZ on expression of endoplasmic reticulum stress protein in H9C2 cells

图3 LPZ对H9C2细胞凋亡相关蛋白表达的影响Figure 3 The effects of LPZ on expression of apoptosis related proteins in H9C2 cells

2.3 ROS抑制剂能缓解LPZ诱导的心肌损伤

为了进一步验证氧化应激在LPZ诱导的内质网应激和细胞凋亡中的作用，本研究使用ROS抑制剂NAC（1 mmol∕L）单独或联合LPZ共同孵育细胞48 h，并用ROS 检测试剂盒和Western blot 检测ROS 和蛋白表达水平的变化。与Con 组相比，LPZ 组ROS 荧光强度增强，而NAC 组和NAC+LPZ 组荧光强度无显著变化（图4），说明NAC 对LPZ 诱导的ROS 荧光增强有显著抑制作用。与Con 组相比，LPZ 组内质网应激蛋白GRP78和CHOP表达增强，而NAC组和NAC+LPZ 组内质网应激蛋白表达无显著变化（图5），说明NAC对LPZ诱导的内质网应激有显著抑制作用。与Con 组相比，LPZ 组内质网应激诱导的凋亡相关蛋白Cleaved⁃Caspase⁃12、Cleaved⁃Caspase⁃3、Cyt C 和Bax∕Bcl⁃2 表达增强，而NAC 组和NAC+LPZ组蛋白表达无显著变化（图6），说明NAC 对LPZ 诱导的凋亡有显著抑制作用。

图4 NAC对LPZ诱导的H9C2细胞氧化应激的影响Figure 4 The effects of NAC on LPZ⁃induced oxidative stress in H9C2 cells

图5 NAC对LPZ诱导的H9C2细胞内质网应激蛋白表达的影响Figure 5 The effects of NAC on expression of LPZ⁃induced endoplasmic reticulum stress proteins in H9C2 cells

图6 NAC对LPZ诱导的H9C2细胞凋亡相关蛋白表达的影响Figure 6 The effects of NAC on expression of LPZ⁃induced apoptosis related proteins in H9C2 cells

3 讨论

LPZ 是苯并咪唑类化合物，口服后在酸性条件下转化为活性代谢物发挥药理活性，抑制胃酸分泌的最后一步。由于临床使用量逐年增加，潜在的不良反应逐渐引起研究者的关注。LPZ在心脏方面的潜在作用存在争议。Patil 等［11］在大鼠体内的研究表明，多次服用LPZ 和奥美拉唑可以通过降低氧化应激和促炎性细胞因子，降低异丙肾上腺素诱发的心肌梗死。然而，Sehested 等［12］的观察性研究结果表明，大剂量PPI 长期使用会诱发缺血性卒中和心肌梗死，6个月内发生缺血性卒中的风险增加29%，发生心肌梗死的风险增加36%。在一项随机双盲多中心研究中，LPZ组230例患者中有4例发生严重不良反应，其中包括心律失常［13］。本研究表明，长期使用LPZ 会诱导心肌细胞氧化应激和内质网应激，导致细胞凋亡。LPZ 需要在胃液中活化后发挥抑酸作用，但是心肌细胞内的pH不足以使LPZ发生质子化，因此本研究采用LPZ原型药物进行实验，符合药物在心脏组织中的实际情况。

心肌缺血或梗死时，心肌细胞和内皮细胞ROS产生会大量增加［14］。ROS 是引起内质网应激的上游信号分子，氧化应激通常会导致内质网应激，参与并调节细胞凋亡过程［15］。内质网是一个广泛的细胞内膜网络，其相关功能在心脏生理和病理中至关重要［16］。某些因素如氧化应激、缺血和钙稳态等会引起内质网应激，内质网的分子伴侣如GRP78和钙网蛋白的产生都会相应增加，也会启动凋亡信号，包括切割的Caspase⁃3 和Caspase⁃12，最终会导致细胞凋亡［17-18］。内质网应激启动的细胞凋亡与各种疾病的病理生理学有关，包括心血管疾病，如心肌肥厚、心力衰竭、动脉粥样硬化和缺血性心脏病［19］。此外，在内质网和线粒体上表达的Bcl⁃2家族也参与调控内质网应激引起的细胞死亡。Bcl⁃2 是抗凋亡因子，Bax是促凋亡因子，Bcl⁃2亚家族蛋白包括Bcl⁃2和Bcl⁃XL，通过抑制Bax亚家族蛋白，阻止线粒体释放Caspase激活因子，从而抑制细胞凋亡。CHOP诱导细胞凋亡的一个重要途径是调节Bcl⁃2 家族促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之间的平衡［19］。本研究用LPZ孵育H9C2不同时间后发现，LPZ能时间依赖性增加ROS荧光，并显著增加GRP78和CHOP的表达，说明长期使用LPZ 能诱导氧化应激，进一步诱导内质网应激。此外，LPZ增加了H9C2细胞Cleaved⁃Caspase⁃12、Cleaved⁃Caspase⁃3、Cyt C 及Bax∕Bcl⁃2的表达，提示LPZ能诱导心肌细胞凋亡。

NAC是一种含有巯基的抗氧化剂，可促进还原谷胱甘肽的合成，加快细胞内自由基的清除［20］。为了进一步验证LPZ诱导的心肌细胞凋亡与氧化应激的相关性，本研究将ROS 抑制剂NAC 单独或联合LPZ共同作用于细胞48h。结果显示，1mmol∕L NAC单独作用于H9C2细胞48 h对ROS荧光和内质网应激相关蛋白的表达没有影响，也不会增加凋亡相关蛋白的表达，但是能显著减弱由LPZ 诱导的ROS 荧光增加，并很大程度上抑制由LPZ 诱导的GRP78、CHOP、Cleaved⁃Caspase⁃12、Cleaved⁃Caspase⁃3、Cyt C 及Bax∕Bcl⁃2 表达增加，这些结果进一步验证了LPZ诱导的心肌细胞损伤与氧化应激有较大相关性。降低心肌细胞ROS水平，阻断调亡信号通路可有效抑制LPZ 诱导的细胞调亡，对LPZ 长期使用导致的心脏不良反应的治疗和预防具有指导意义。

综上所述，临床相关浓度的LPZ 可能通过氧化应激诱导心肌细胞损伤。本研究表明ROS可作为预防LPZ相关心脏不良反应的潜在靶点，可以进行深入研究。NAC通过抗氧化作用减少心肌细胞调亡，从而保护心脏，这对LPZ临床合理使用有重要作用。