小鼠脊髓损伤后Bmi⁃1在脊髓中的表达变化

金瑶瑶，赵伟华，高 钰，肖晨宇，张永杰*

1南京医科大学人体解剖学系，2衰老及相关疾病研究重点实验室，江苏 南京 211166；3南京中医药大学附属常州市中医医院骨科，江苏 常州 213003；4南京医科大学第一临床医学院，江苏 南京 211166

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）可由跌落、交通事故、脊髓缺血或肿瘤等引起［1-2］。SCI 患者常面临瘫痪、感觉障碍、神经性疼痛等系列问题，给个人、家庭和社会带来沉重负担［3］。研究者始终致力于探索药物、不同术式、干细胞与生物材料移植、电生理与功能锻炼、智能假肢等多种方法治疗SCI，但至今临床尚缺乏行之有效的治疗途径［4-5］。因此，进一步探索SCI后的病理生理改变及相关机制显得极为重要。

B 淋巴瘤Mo⁃MLV 插入区1（B lymphoma Mo⁃MLV insertion region 1，Bmi⁃1）是多梳抑制蛋白复合物1（polycomb repressive complex 1，PRC1）的重要成员之一［6-7］，可调节细胞增殖、生长、DNA 修复、凋亡和衰老［8-9］。既往研究显示，自胚胎发育起至成年，Bmi⁃1 在广泛脑区与脊髓中均有表达［10］。Bmi⁃1 敲除小鼠（Bmi⁃1 KO）可存活1～2 个月，在2～4 周时出现共济失调，小脑颗粒层与浦肯野氏细胞减少，海马神经元退行性变，胼胝体区星形胶质细胞增生等［11］。本课题组前期结果显示Bmi⁃1 在脑发育、脑功能及脑衰老中均有重要作用［12］。但Bmi⁃1在脊髓损伤后病理进程中的表达变化及作用尚未见报道。

因此，本研究利用LISA 脊髓损伤造模仪制作T9 脊髓中度钝挫伤模型小鼠，采用Western blot 及免疫荧光染色观察Bmi⁃1 在SCI 后不同时间点的表达及细胞定位，初步探索Bmi⁃1 在脊髓损伤后病理进程中的表达变化。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物及动物分组

实验用8～10周龄雌性C57Bl∕6小鼠共60只，动物随机分为两组：对照组（即假手术组，n=10）和手术组（n=50）。小鼠饲养、管理及使用均严格按照南京医科大学实验动物管理规范进行（IACUC：1809007）。

1.1.2 试剂和仪器

单克隆兔抗神经元核心抗原（neuronal nuclei antigen，NeuN）抗体（Abcam 公司，美国），单克隆大鼠抗髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）抗体（Millipore公司，美国），多克隆兔抗神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗体（Millipore公司，美国），多克隆兔抗离子钙接头蛋白分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba⁃1）抗体（Wako 公司，日本），单克隆大鼠抗血小板内皮细胞黏附分子1（platelet and endothelial cell adhesion molecule⁃1，PFCAM⁃1∕yCD31）抗 体（BD Pharmingen 公司，美国），单克隆小鼠抗Bmi⁃1 抗体（Abgent 公司，美国）。Alex Fluor 594 标记驴抗小鼠IgG、Alex Fluor 488 标记驴抗大鼠IgG、Alex Fluor 488 标记驴抗兔IgG（Jackson ImmunoResearch 公司，美国），DAPI（sigma 公司，美国），多克隆兔抗PCNA抗体（Proteintech公司，美国），HRP标记的单克隆小鼠抗GAPDH 抗体（Proteintech 公司，美国），羊抗小鼠IgG⁃HRP、羊抗兔IgG⁃HRP（KPL 公司，美国）。BCA 蛋白检测试剂盒（Bio⁃Rad 公司，加拿大），FCL免疫印迹检测试剂盒（Amersham Pharmacia公司，美国）。

LISA脊髓损伤造模仪（美国Norton 神经科学研究中心Dr.Shields馈赠）、冰冻切片机（Thermo Fisher公司，美国）、正置荧光显微镜及图像采集系统（Leica公司，美国）、蛋白电泳仪及成像系统（Bio⁃Rad公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 动物手术

小鼠采用1%戊巴比妥钠（50 mg∕kg，腹腔注射）麻醉，固定于LISA 小鼠固定支架，行T9 椎板切除术。手术组采用LISA脊髓损伤造模仪制作T9脊髓中度钝性撞击模型，损伤深度0.6 mm［13］；假手术组只行T9 椎板切除术。分层缝合肌肉与皮肤。术后动物置30 ℃加热垫苏醒恢复，每天两次膀胱护理，至膀胱排尿功能恢复后行术后常规护理与喂养。

1.2.2 组织取材与切片

动物手术后将手术组小鼠随机分为5 组，每组10 只。分别于术后1、3、7、14、28 d 采用1%戊巴比妥钠麻醉小鼠，其中每组6只小鼠经左心室4%多聚甲醛灌注后，取距损伤中心头尾侧各5 mm范围内脊髓组织，继行4%多聚甲醛固定，梯度浓度蔗糖脱水，OTC包埋后行冠状位冰冻切片，片厚10 μm；4只经左心室生理盐水灌注后，取距损伤中心头尾侧各5 mm 范围内脊髓组织，用于提取蛋白行Western blot检测。假手术组10只，于椎板切除术后28 d时，同上取6只行4%多聚甲醛灌注取材，4只行生理盐水灌注取材。

1.2.3 免疫荧光染色

冰冻切片经37 ℃30 min 烘干后，常规PBS 洗涤，用含0.1%Triton X⁃100的10%驴血清和0.5%牛血清白蛋白（BSA）室温封闭1 h。一抗为单克隆兔抗NeuN 抗体（1∶1 000）、单克隆大鼠抗MBP 抗体（1∶50）、多克隆兔抗GFAP 抗体（1∶500）、多克隆兔抗Iba⁃1 抗体（1∶100）、单克隆大鼠抗CD31 抗体（1∶100）、单克隆小鼠抗Bmi⁃1抗体（1∶500），4 ℃孵育过夜；加相应二抗，Alex Fluor 594 标记驴抗小鼠IgG、Alex Fluor 488 标记驴抗大鼠IgG、Alex Fluor 488 标记驴抗兔IgG（1∶1 000），37 ℃孵育1 h；DAPI（1∶1 000）孵育10 min，甘油封片后于Leica正置荧光显微镜观察摄片。使用Image⁃Pro Plus 5.0.1 软件分析Bmi⁃1 与Iba⁃1、CD31、NeuN 与GFAP 双阳性细胞百分率，Bmi⁃1 与MBP 双阳性细胞与纤维的面积百分比，每只小鼠脊髓的相应观察区至少计数3张切片，结果取平均值。

1.2.4 Western blot实验

脊髓组织按1∶20质量∕体积比加入RIPA，剪碎、匀浆，冰上静置30 min，13 000 r∕min 4 ℃离心15 min，提取蛋白，采用BCA法行蛋白定量。每组蛋白加样20 μg，蛋白经10%SDS⁃PAGF分离后湿转至甲醇处理的PVDF 膜。含5% 脱脂奶粉的PBST 37 ℃封闭2 h，加入一抗单克隆小鼠抗Bmi⁃1 抗体（1∶1 000）、多克隆兔抗增殖细胞核抗原（proliferating cell nucle⁃ar antigen，PCNA）抗体（1∶2 000）、HRP 标记的小鼠抗GAPDH 单克隆抗体（1∶5 000），4 ℃孵育过夜。PBST洗涤后，加入相应二抗HRP⁃标记山羊抗兔IgG或HRP⁃标记山羊抗小鼠IgG（1∶2 000），室温孵育1 h。按FCL 免疫印迹检测试剂盒步骤加入发光混合液，自动成像仪曝光，保存图像。使用Image⁃Pro Plus 5.0.1软件分析发光强度。

1.3 统计学方法

使用GraphPad Prism 6.0 软件进行分析。各组数据以均数±标准差（）表示。采用单因素方差分析（one⁃way ANOVA）进行多组间数据比较，采用SNK 法对多组间数据进行两两比较，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SCI后小鼠脊髓组织病理学变化

为观察脊髓钝挫伤后的组织缺损变化，首先观察SCI后1、3、7、14、28 d时损伤灶周围的血肿改变，继而采用髓鞘标识物MBP 免疫荧光染色分别观察上述时间点损伤灶及周围MBP 的表达情况。结果显示，SCI术后1 d和3 d时，局部血肿显著；与术后1 d或3 d相比，术后7 d起，血肿面积明显减小；至术后14 d 与28 d 时，损伤灶表面血肿已不明显（图1A、B）。MBP免疫荧光染色结果显示：假手术对照组小鼠的脊髓中MBP阳性细胞与纤维分布规则，脊髓灰质与白质境界清晰；手术组（SCI后1、3、7 d）小鼠，脊髓损伤灶中央主要为空洞及坏死区域、邻近区域MBP 阳性细胞与纤维分布杂乱，灰白质境界不清。至损伤14 d 后，损伤区面积逐渐变小，损伤灶与周围组织之间的边界逐渐清晰。为进一步观察损伤后Bmi⁃1 在不同损伤时间点的表达及细胞定位变化，取损伤边缘区观察Bmi⁃1在小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、血管内皮细胞上的表达变化。取脊髓前角观察Bmi⁃1在神经元上的表达变化（图1C）。

图1 小鼠SCI后1、3、7、14、28 d的脊髓组织血肿与损伤灶变化Figure 1 The changes of haematoma and contusitive area in spinal cord at the day of 1，3，7，14 and 28 post SCI

2.2 Bmi⁃1在SCI后的表达与细胞定位变化

为进一步观察Bmi⁃1在脊髓损伤后的表达与细胞定位，取脊髓损伤后不同时间点的脊髓冠状切片，分别行Bmi⁃1 与Iba⁃1（小胶质细胞标志）、MBP（髓鞘细胞标志）、NeuN（神经元标志）、GFAP（星形胶质细胞标志）及CD31（血管内皮细胞标志）免疫荧光双染。结果显示：假手术对照组中可见部分Bmi⁃1与Iba⁃1双阳性细胞，SCI后1、3、7、14、28 d时，Bmi⁃1与Iba⁃1双阳性细胞显著增加，Bmi⁃1在小胶质细胞中的表达持续增高（图2、图3A）；与假手术对照组相比，Bmi⁃1 与MBP 双阳性细胞及纤维的面积百分比在SCI 后3、7、14、28 d 时表达均增高（图4、图3B）；Bmi⁃1 与NeuN 双阳性细胞在假手术对照组中极少，在SCI 后1 d、3 d、7 d 时增加，在SCI 后14 d 与28 d 时，与假手术对照组间的差异无统计学意义（图5、图3C）；与假手术对照组相比，Bmi⁃1 与CD31双阳性细胞在SCI 后3 d、7 d 显著增加，SCI 后1 d、14 d、28 d 时与假手术对照组间差异无统计学意义（图6、图3D）；假手术对照组小鼠脊髓中，偶见Bmi⁃1与GFAP双阳性细胞，SCI后的小鼠脊髓中，未发现明显的Bmi⁃1与GFAP双阳性细胞或纤维（图7、图3F）。

图2 小鼠SCI后1、3、7、14、28 d脊髓损伤灶边缘Bmi⁃1与Iba⁃1双阳性细胞变化Figure 2 The changes of Bmi⁃1 and Iba⁃1 double positive cells around of the contusitive margin in spinal cord at the day of 1，3，7，14 and 28 post SCI

图3 小鼠SCI 后1、3、7、14、28 d 脊髓损伤灶边缘处Iba⁃1/Bmi⁃1、NeuN/Bmi⁃1、CD31/Bmi⁃1、GFAP/Bmi⁃1 双阳性细胞百分率，MBP/Bmi⁃1双阳性面积变化的统计结果Figure 3 The statistical analysis of the ratio of the double positive cells as Iba⁃1/Bmi⁃1，NeuN/Bmi⁃1，CD31/Bmi⁃1 and GFAP/Bmi⁃1，and the ratio of the MBP/Bmi⁃1 double positive area around of the contusitive margin in spinal cord at the day of 1，3，7，14 and 28 post SCI

图4 小鼠SCI后1、3、7、14、28 d脊髓损伤灶边缘Bmi⁃1与MBP双阳性细胞变化Figure 4 The changes of Bmi⁃1 and MBP double positive cells around of the contusitive margin in spinal cord at the day of 1，3，7，14 and 28 post SCI

图5 小鼠SCI后1、3、7、14、28 d脊髓前角的Bmi⁃1与NeuN双阳性细胞变化Figure 5 The changes of Bmi⁃1 and NeuN double positive cells in the anterior horn of spinal cord at the day of 1，3，7，14 and 28 post SCI

图6 小鼠SCI后1、3、7、14、28 d脊髓损伤灶边缘的Bmi⁃1与CD31双阳性细胞变化Figure 6 The changes of Bmi⁃1 and CD31 double positive cells around of the contusitive margin in spinal cord at the day of 1，3，7，14 and 28 post SCI

图7 小鼠SCI后1、3、7、14、28 d脊髓损伤灶边缘的Bmi⁃1与GFAP表达变化Figure 7 The expression of Bmi⁃1 and GFAP around of the contusitive margin in spinal cord at the day of 1，3，7，14 and 28 post SCI

2.3 SCI后脊髓组织中Bmi⁃1蛋白水平表达变化

为检测SCI 后不同时间点脊髓组织中Bmi⁃1 的蛋白表达变化，通过蛋白印迹法检测假手术组和脊髓损伤后1、3、7、14、28 d时小鼠脊髓损伤灶周围组织中Bmi⁃1 蛋白的表达。结果显示：与假手术对照组相比，SCI小鼠脊髓损伤灶周围组织中Bmi⁃1的表达于损伤后1 d 时即显著增加并达峰值（P<0.01），后逐渐下降，且在损伤后28 d内始终保持较高的表达（与假手术对照组比较，SCI 后3 d，P<0.01；与假手术对照组比较，SCI 后7 d、14 d、28 d，P<0.05，图8A、B）。同时检测了增殖指标PCNA 在脊髓损伤后的表达变化，结果显示与假手术对照组相比，SCI小鼠脊髓损伤灶周围组织中PCNA的表达在损伤后3 d时显著增加并达峰值（P<0.01），7 d 时表达仍上调（P<0.01），后逐渐下降，与假手术对照组间差异无统计学意义（图8A、C）。

图8 小鼠SCI后1、3、7、14、28 d脊髓损伤局部Bmi⁃1与PCNA的表达变化Figure 8 The expression of Bmi⁃1 and PCNA in spinal cord at the day of 1，3，7，14 and 28 post SCI

3 讨论

Bmi⁃1 可影响多种细胞进程的基因表达，调节细胞增殖、生长、DNA 修复、凋亡和衰老［9］。同时，Bmi⁃1可通过负调节细胞周期依赖性激酶抑制因子p16Ink4a和p19Arf的转录而促进干细胞自我更新［14］。本课题组既往研究显示Bmi⁃1 缺失（Bmi⁃1KO）小鼠脑内氧化应激反应加剧、神经元突触丢失、轴突脱髓鞘、出现反应性胶质增生及线粒体损伤［15-16］，小鼠出现早老性神经元退变［17］。上述研究提示Bmi⁃1在脑发育与功能维持及脑衰老中均具有重要作用，可能与抗氧化应激、抑制线粒体损伤、促细胞增殖相关。而氧化应激、线粒体损伤均为脊髓损伤后二次损伤中的重要病理过程［18］，但Bmi⁃1 在脊髓损伤后的表达变化及可能作用尚未见相关报道。

脊髓损伤是一种严重致残的神经系统损伤，尤其在二次损伤中伴发的一系列病理生理改变（如炎症、氧化应激、缺血缺氧和脱髓鞘病变等），可加剧损伤程度并抑制神经再生［19］。为初步探索Bmi⁃1在脊髓损伤后的变化及可能作用，本研究采用2 月龄雌性C57Bl∕6 小鼠建立脊髓中度钝挫伤模型，在损伤后不同时间点观察Bmi⁃1 的表达及细胞定位变化。首先，采用MBP染色观察脊髓钝挫伤后不同时间点损伤灶大小的变化，结果与先前采用LISA脊髓造模仪制作的脊髓中度钝挫伤小鼠的术后损伤灶变化趋势一致［20］，说明本研究造模成功。

继而采用蛋白印迹检测SCI后Bmi⁃1在脊髓中的表达变化，采用免疫荧光双染初步观察SCI后Bmi⁃1在脊髓中不同类型细胞中的表达变化。因损伤中心区主要为坏死组织，故取损伤边缘区观察Bmi⁃1在小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、血管内皮细胞上的表达变化［21］。同时，由于损伤灶在术后面积变化较大，边缘区的神经元类型及分布不均一，不利于观察Bmi⁃1在神经元上的变化；且脊髓前角在该模型鼠中亦受影响［20］，故取脊髓前角观察Bmi⁃1 在神经元上的表达变化［22］。结果显示Bmi⁃1在脊髓损伤后1 d 表达即增加并达峰值，在损伤后28 d 时仍保持较高水平，且Bmi⁃1 的表达变化趋势与增殖指标PCNA的表达变化趋势相对一致。免疫荧光染色结果显示，Bmi⁃1 与Iba⁃1、MBP、NeuN、CD31双阳性细胞在脊髓损伤后均有增加，且Bmi⁃1与Iba⁃1双阳性细胞的增加尤为显著。

小胶质细胞是脊髓的固有免疫细胞［23］，在维持脊髓微环境稳态、促进吞噬及释放ROS等方面起重要作用。本研究首次发现Bmi⁃1 与Iba⁃1 双阳性细胞在SCI后显著增加，Bmi⁃1在小胶质细胞中持续高表达。提示Bmi⁃1 可能与SCI 后小胶质细胞的活化密切相关，对SCI 后的炎性反应具有重要作用。MBP 阳性的少突胶质细胞是脊髓中的成熟髓鞘细胞［24］。免疫荧光结果显示，Bmi⁃1 与MBP 双阳性细胞及纤维在SCI后3、7、14、28 d时表达均增高。Bmi⁃1在髓鞘细胞中的表达变化可能与SCI后发生的内源性髓鞘再生、分化与成熟有关［25］，提示Bmi⁃1可能参与SCI后髓鞘细胞的再生与成熟。因神经元为分化成熟的细胞，故Bmi⁃1 在对照组小鼠的脊髓神经元中表达较低，而在SCI后1～7 d表达上调，提示Bmi⁃1在SCI后在神经元上的表达上调，可能与SCI后神经元性损伤反应［26］或与内源性胶质细胞转分化为功能性神经元［27-28］相关。在神经组织重塑过程中，神经发生与血管新生密切相关［29-30］。先前研究表明，血管生成发生在脊髓损伤后3～4 d，并持续长达1周［31］。本研究结果与此一致，且首次发现Bmi⁃1 与CD31双阳性细胞在SCI 后3～7 d 显著增加，提示Bmi⁃1 可能与SCI 后血管发生相关。SCI 后，星形胶质细胞出现增生性反应，GFAP 表达增加，并形成神经胶质瘢痕［32］。但本研究在SCI小鼠的脊髓中未观察到明显的Bmi⁃1 与GFAP 双阳性细胞。后续研究将进一步采用星形胶质细胞不同标志物，如谷氨酸转运体1（glutamate transporter 1，GLT1）、谷氨酸∕天门冬氨酸转运蛋白（glutamate∕aspartic transporter，GLAST）［33-34］等检测Bmi⁃1 在SCI 后星形胶质细胞不同发生阶段或不同亚型上的表达。

不足的是，本研究为在体观察结果，尚不能明确SCI后，Bmi⁃1在上述细胞中的表达变化是由细胞自身变化所致还是由SCI 后微环境改变间接引起，故后续研究将进一步行体外细胞培养实验，以明确上述细胞损伤后Bmi⁃1的表达变化。

综上所述，本研究首次发现，Bmi⁃1 在SCI 后表达增加，在髓鞘细胞、神经元、血管内皮细胞上均有表达，且在小胶质细胞上的表达尤为显著。提示Bmi⁃1在脊髓损伤后的表达变化可能与小胶质细胞的增殖与活化、内源性髓鞘再生及血管内皮细胞的活化有关，可能在脊髓损伤后的病理过程中具有重要意义。