芒柄花黄素联合下调miR-4326对肝癌细胞HCCLM3生长和侵袭的影响

章 涵， 赵玉霞， 杨惠然， 董 雪

(河南省信阳职业技术学院，信阳职业技术学院附属医院，河南 信阳 464000)

肝癌已经成为世界范围内影响人类生命健康的恶性肿瘤之一，其发展速度快、恶性程度高，很多肝癌患者在确诊时已经发生了远端转移，手术切除、放疗等是目前肝癌治疗的常见手段，这些技术手段虽然已经取得了明显的成效，但远远不能满足需求[1]。近些年来，随着人们对肿瘤分子发生机制的不断研究发现，基因靶向治疗具有准确性高、副作用小等特点，已经成为肿瘤研究中的热点[2]。中草药提取物来源广泛、不良反应较小，也是抗肿瘤中的研究重点，芒柄花黄素是从豆科植物红色车轴草中提取的一种雌激素，有抗炎、降血压等功效[3]。芒柄花黄素有抗肿瘤作用，其可以降低膀胱癌、卵巢癌等肿瘤细胞恶性生长能力[4-5]。miRNA在人体内有多种生物学作用，广泛参与细胞生长、运动、代谢等过程[6]，还与肿瘤的关系密切，可能是肿瘤治疗的分子靶点[7]。既往的研究表明，miR-4326在肺癌进展中发挥促进作用，下调其表达可以抑制肺癌细胞的侵袭和迁移能力[8]。现阶段对于miR-4326和芒柄花黄素在肝癌进展中的作用尚不明确，本实验探讨下调miR-4326联合芒柄花黄素干预对肝癌细胞生长、侵袭和迁移的影响和机制，为提高肝癌患者生存时间的用药提供实验基础。

1 材料

1.1 细胞 肝癌细胞HuH-7、SNU-449、HCCLM3购自上海赛默飞生物科技有限公司；正常肝细胞HL7702购自北京晶莱华科生物技术有限公司。

1.2 试剂与药物 芒柄花黄素对照品(纯度>98%，批号MB1978)购自大连美仑生物技术有限公司。E-cadherin抗体购自武汉艾美捷科技有限公司；β-catenin抗体、c-Myc抗体购自美国Santa Cruz公司；miR-4326抑制物、抑制物阴性对照购自苏州吉玛基因股份有限公司；Vimentin抗体购自上海研晶生物技术有限公司；miRNA第一链cDNA合成试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司。

2 方法

2.1 RT-qPCR检测肝癌细胞中miR-4326表达 用Trizol试剂提取肝癌细胞HuH-7、SNU-449、HCCLM3和正常肝细胞HL7702中总RNA，紫外分光光度计测定A260/A280在1.8～2.0之间。根据miRNA第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA，逆转录反应体系为0.5 μL Quant RTase、2 μL RT primer、1 μL Super pure dNTPs、2 μL Poly(A)反应溶液、1 μL RNasin、2 μL RT Buffer，用RNase-free ddH2O补充至总体积为20 μL，充分混合以后，于37 ℃孵育结合60 min，将合成的cDNA置于-20 ℃条件下保存。取cDNA，放在冰上配制PCR反应体系，1 μL cDNA、10 μL miRcure miRNA premix、0.4 μL 正向引物、0.4 μL反向引物，用RNase-free ddH2O补充至总体积为20 μL，94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，共40个循环。以2-△△CT法计算miR-4326表达，内参为U6。引物序列为miR-4326正向5′-GCCCGCTGTTCCTCTGTCTCCC-3′，反向5′-GTGCAGGGTCC GAGGT-3′。

2.2 MTT法检测细胞增殖 将HCCLM3细胞密度调整为4×105/mL，吸取100 μL细胞悬液接种到96孔板，在细胞中加入含浓度为0、15、30、60、120 μmol/L芒柄花黄素的细胞培养液，将培养板置于37 ℃培养箱内继续培养24 h，加入10 μL MTT溶液，置于37 ℃环境中反应4 h，弃上清，每孔加入150 μL DMSO，反应10 min，采用酶标仪检测450 nm波长处吸光度值(A)，以A值表示细胞增殖能力。

2.3 细胞分组及处理 HCCLM3细胞分成对照组(不作处理)、anti-miR-NC组(转染抑制物阴性对照)、anti-miR-4326组(转染miR-4326抑制物)、anti-miR-NC+芒柄花黄素组(转染抑制物阴性对照+30 μmol/L芒柄花黄素)、anti-miR-4326+芒柄花黄素组(转染miR-4326抑制物+30 μmol/L芒柄花黄素)。对照组、anti-miR-NC组、anti-miR-4326组细胞培养24 h后，RT-qPCR法检测miR-4326表达；对照组、anti-miR-NC组、anti-miR-4326组、anti-miR-NC+芒柄花黄素组、anti-miR-4326+芒柄花黄素组细胞培养24 h后，MTT法检测细胞增殖。转染试剂为 Lipofectamine 2000，按照转染试剂操作说明进行转染。

2.4 Transwell小室检测细胞侵袭和迁移 各组细胞分别悬浮在不含胎牛血清的细胞培养液内，细胞密度为1×105/mL。侵袭实验前在Transwell小室内加入Matrigel将小室湿化2 h，接着取200 μL上述细胞悬液至Transwell小室的上室，同时在下室内加入500 μL含胎牛血清的细胞培养液，放在培养箱内继续培养24 h后，取出小室，用棉签将没有穿膜的细胞擦掉，多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色，在显微镜下观察细胞穿膜数目，随机选择6个视野，计数分析。

2.5 Western blot检测细胞中E-cadherin、Vimentin、β-catenin、c-Myc蛋白表达 收集培养24 h的各组细胞，预冷的PBS溶液重复洗涤细胞2次，加入细胞裂解液，置于冰上裂解30 min，12 000×g离心20 min，吸取上清，即为总蛋白，蛋白定量后和上样缓冲液均匀混合，煮沸5 min进行变性，于-80 ℃保存。常规方法分别制备10%分离胶、5%浓缩胶，吸取蛋白样品加入到上样孔内，每孔30 μg蛋白样品，设置电压80 V、100 V，半干式方法进行转膜，设置2.5 mA/cm2恒定电流冰浴转膜，5%脱脂奶粉封闭1.5 h，置于一抗溶液(E-cadherin、Vimentin、c-Myc均以1∶1 000稀释)中结合反应2 h，然后放在二抗溶液(1∶4 000稀释)中结合反应2 h，ECL显色试剂盒显色，用Image J软件分析条带A值，GAPDH为内参蛋白，计算目蛋白的相对表达。

2.6 Wnt/β-catenin信号通路激活剂对HCCLM3细胞增殖、迁移、侵袭影响 取转染miR-4326抑制物后的HCCLM3细胞，用含有30 μmol/L芒柄花黄素和30 mmol/L Wnt/β-catenin信号通路激活剂LiCl的细胞培养液培养，命名为anti-miR-4326+芒柄花黄素+LiCl组。以anti-miR-4326+芒柄花黄素组为参照，MTT检测细胞增殖，Transwell小室检测细胞侵袭和迁移，Western blot检测E-cadherin、Vimentin、β-catenin、c-Myc蛋白表达。

3 结果

3.1miR-4326在肝癌细胞中表达上调 如表1所示，肝癌细胞HuH-7、SNU-449、HCCLM3中miR-4326表达高于正常肝细胞HL7702(P<0.05)。本研究选择miR-4326相对表达最高的肝癌细胞HCCLM3进行后续实验。

表1 miR-4326在肝癌细胞HuH-7、SNU-449、HCCLM3和正常肝细胞HL7702中的表达

3.2 芒柄花黄素对HCCLM3细胞增殖的影响 如表2所示，与对照组(0 μmol/L芒柄花黄素)比较，芒柄花黄素干预后，HCCLM3细胞增殖活性降低(P<0.05)，30 μmol/L芒柄花黄素干预后，肝癌细胞存活率接近50%，选用30 μmol/L芒柄花黄素进行后续实验。

表2 芒柄花黄素处理后HCCLM3细胞增殖活性比较

3.3 miR-4326抑制物对HCCLM3细胞中miR-4326表达的影响 如表3所示，与anti-miR-NC组比较，转染miR-4326抑制物后，HCCLM3细胞中miR-4326表达降低(P<0.05)。提示，miR-4326抑制物能下调HCCLM3细胞中miR-4326表达。

表3 miR-4326抑制物转染后HCCLM3细胞中miR-4326表达比较

3.4 芒柄花黄素联合下调miR-4326对HCCLM3细胞增殖、侵袭和迁移的影响 如图1、表4所示，与anti-miR-NC组比较，下调miR-4326或芒柄花黄素处理后，HCCLM3细胞增殖活性、侵袭数目、迁移数目均降低(P<0.05)，细胞中E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05)，Vimentin蛋白表达降低(P<0.05)；与anti-miR-4326组或anti-miR-NC+芒柄花黄素组比较，芒柄花黄素联合下调miR-4326能够协同降低肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力(P<0.05)，提高细胞中E-cadherin蛋白表达(P<0.05)，降低细胞中Vimentin蛋白表达(P<0.05)。

注：a～e分别为对照组、anti-miR-NC组、anti-miR-4326组、anti-miR-NC+芒柄花黄素组、anti-miR-NC+芒柄花黄素组。图1 各组HCCLM3细胞侵袭、迁移能力(A)和E-cadherin、Vimentin蛋白表达(B)

表4 芒柄花黄素联合下调miR-4326对HCCLM3细胞的影响

3.5 芒柄花黄素联合下调miR-4326对HCCLM3细胞Wnt/β-catenin信号通路激活的影响 如图2、表5所示，与anti-miR-NC组比较，下调miR-4326或芒柄花黄素干预后，HCCLM3细胞中β-catenin、c-Myc蛋白表达降低(P<0.05)；与anti-miR-4326组或anti-miR-NC+芒柄花黄素组比较，芒柄花黄素联合下调miR-4326能够协同降低HCCLM3细胞中β-catenin、c-Myc蛋白表达(P<0.05)。提示，芒柄花黄素联合下调miR-4326能抑制HCCLM3细胞中Wnt/β-catenin信号通路的激活。

注：a～e分别为对照组、anti-miR-NC组、anti-miR-4326组、anti-miR-NC+芒柄花黄素组、anti-miR-NC+芒柄花黄素组。图2 各组HCCLM3细胞中β-catenin、c-Myc蛋白表达

表5 芒柄花黄素联合下调miR-4326对HCCLM3细胞β-catenin、c-Myc蛋白表达的影响

3.6 Wnt/β-catenin信号通路激活剂对HCCLM3细胞增殖、侵袭、迁移及相关蛋白的影响 如图3、表6所示，与未经LiCl处理的细胞比较，LiCl处理提高了芒柄花黄素联合下调miR-4326处理的HCCLM3细胞增殖、侵袭和迁移能力(P<0.05)，提高了细胞中β-catenin、c-Myc、Vimentin蛋白表达(P<0.05)，降低了细胞中E-cadherin蛋白表达(P<0.05)。

表6 Wnt/β-catenin信号通路激活剂对HCCLM3细胞的影响

注：a为anti-miR-4326+芒柄花黄素组，b为anti-miR-4326+芒柄花黄素+LiCl组。图3 各组HCCLM3细胞侵袭、迁移(A)和Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达(B)

4 讨论

芒柄花黄素又名刺芒柄花素，是我国传统中药黄芪的主要活性成分之一，有调节免疫、改善炎症等作用[9]，还具有抗肿瘤作用，可以抑制宫颈癌、结直肠癌、胃癌等肿瘤细胞的恶性生长和转移[10-12]。本实验结果显示，芒柄花黄素处理后，HCCLM3肝癌细胞增殖能力降低，细胞侵袭和迁移能力降低，提示芒柄花黄素抑制HCCLM3细胞生长、侵袭和迁移。

miRNA是一类没有编码能力的小分子RNA，在自然界的真核生物体内存在，参与调控细胞分化、胚胎发育、能量代谢等过程。miRNA与人类多种疾病有关，参与疾病的病理进展，可能是疾病治疗的靶向调节分子[13]。miR-4326是近些年来发现的与肿瘤有关的miRNA，在肺癌、多发性骨髓瘤等肿瘤中表达上调，并且下调miR-4326表达可以抑制肿瘤细胞的生长、迁移、侵袭[8,14]。本实验结果表明，miR-4326在肝癌细胞中的表达高于正常肝细胞，下调miR-4326可以降低肝癌细胞增殖、侵袭和迁移能力，提示miR-4326在肝癌进展中可能扮演类似癌基因的作用，靶向抑制miR-4326可能是肝癌治疗的有效途径。

肿瘤的转移是一个复杂的过程，不仅与肿瘤细胞的侵袭、迁移能力等有关，还与肿瘤细胞EMT有关[15]。研究表明，发生EMT的肿瘤细胞的侵袭、迁移能力明显增加，EMT被认为是肿瘤转移的早期标志[16]。Vimentin是间质细胞标志蛋白，E-cadherin是上皮细胞标志蛋白，二者的表达是EMT水平的标志[17]。本实验结果显示，下调miR-4326和芒柄花黄素均可降低HCCLM3细胞中Vimentin表达，提高E-cadherin表达，并且二者联合作用效果更好，提示芒柄花黄素联合下调miR-4326抑制HCCLM3细胞增殖和转移潜能。

Wnt/β-catenin是经典Wnt信号通路，在人体组织中广泛表达，参与多种病理和生理过程[18]。Wnt/β-catenin影响细胞生长、代谢等过程，与动脉粥样硬化、关节炎等疾病有关[19-20]。Wnt/β-catenin在肿瘤进展中过度激活，其活化后诱导肿瘤转移和生长，抑制其激活具有抵抗肿瘤细胞增殖、迁移的作用[21]。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的关键蛋白，c-Myc是Wnt/β-catenin信号通路的下游靶点[22]。以往研究发现，芒柄花黄素调控肿瘤细胞中Wnt/β-catenin信号通路[23]。本实验结果显示，芒柄花黄素和下调miR-4326后，HCCLM3细胞中β-catenin、c-Myc蛋白表达均降低，并且激活Wnt/β-catenin通路可以逆转芒柄花黄素联合下调miR-4326对HCCLM3细胞的抑制作用，这提示芒柄花黄素联合下调miR-4326通过Wnt/β-catenin影响HCCLM3细胞生长、侵袭和迁移。

综上所述，芒柄花黄素联合下调miR-4326可能是肝癌治疗的途径之一，可以抑制HCCLM3细胞的增殖、侵袭、迁移和EMT，其机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。这为临床上提高肝癌患者生活质量提供了参考，为研究芒柄花黄素和下调miR-4326抗肿瘤机制提供了实验基础。