4种提取方法对广枣多糖含量及性质的影响

宝力道， 朱景涛， 赵玉英*

(1.赤峰学院口腔医学院，赤峰学院附属医院，内蒙古 赤峰 024000；2.广州华夏职业学院卫建学院，广东 广州 510900)

广枣为藏、蒙医习用的重要药材，主要用于气滞血瘀、胸痹作痛、心悸气短、心神不安等疾病[1]。多糖是来自于高等植物、动物细胞膜、微生物细胞壁中的天然大分子，也是一切生物体维持生命活动所需要能量的主要来源和生物体合成其他化合物的基本原料。多糖的糖链能控制细胞的分裂与分化、调节细胞的生长、延缓衰老、增强机体的免疫等[2-3]。近些年来对多糖生物活性的研究日趋广泛，相继发现糖类物质具有抑制氧自由基、抗病毒、抗辐射、抗艾滋病、降血脂、诱导干扰素产生，以及与DNA复合而抑制细菌和肿瘤细胞繁殖的功能，起到抗菌抑菌、抑制肿瘤细胞生成的作用[4-7]。多糖结构特征研究的报道较多[8-10]，并在很多领域被广泛应用[11-12]。用不同方法提取的多糖其结构和生物活性有所不同[13]，本研究对广枣多糖的提取方法、结构、活性进行研究，以期为其产品的开发和应用提供依据。

1 材料

1.1 药物 广枣购自通辽蒙王医药有限责任公司中药饮片厂，经内蒙古民族大学布和巴特教授鉴定为正品，采用中药粉碎机粉碎成粉末后，过80目筛备用。

1.2 仪器 Nicolet Nexus 670FT红外光谱仪(美国Nicolet公司)；紫外光-240分光光度计(日本岛津公司)；D8 FOCUS型X射线衍射仪(德国Bruker公司)。

1.3 试剂 SephadexC-25(瑞典Pharmacia公司)；透析袋(批号MD44-3500，美国Viskase公司)。葡萄糖(纯度≥98%，批号BCY-000577，江西佰草源生物科技有限公司)；复合酶(纤维素酶+果胶酶，浓度≥15 000 U/g，国药集团化学试剂有限公司)。苯酚、95%乙醇、丙酮、乙醚、浓硫酸、氢氧化钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 多糖提取

2.1.1 水提法 称取广枣粉末300 g，转移至3 000 mL锥形瓶中，加入2 400 mL水浸泡24 h，80 ℃水浴加热，搅拌提取3 h，固液分离，重复3次，合并提取液，减压浓缩至原体积的10%，加入浓缩液体积5倍量的95%乙醇，沉淀静置24 h，抽滤，依次用乙醇、甲醇、乙醚洗涤，减压抽滤，低温干燥，即得水提浅灰色粗多糖。

2.1.2 碱提法 称取广枣粉末300 g，转移至3 000 mL锥形瓶中，加入NaOH溶液(pH 9)2 400 mL，浸泡24 h，80 ℃水浴加热，搅拌提取3 h，固液分离，重复3次，合并提取液，减压浓缩至原体积的10%，加入浓缩液体积5倍量的95%乙醇，沉淀静置24 h，抽滤，依次用乙醇、甲醇、乙醚洗涤，减压抽滤，低温干燥，即得碱提深灰色粗多糖。

2.1.3 超声法 取300 g广枣粉末，按1∶8比例加入超纯水，超声提取30 min(超声功率300 W、频率40 kHz)，抽滤，重复2次，合并提取液，减压浓缩至原体积的10%，加入浓缩液体积5倍量的95%乙醇，沉淀静置24 h，抽滤，依次用乙醇、甲醇、乙醚洗涤，减压抽滤，低温干燥，即得超声提浅灰色粗多糖。

2.1.4 酶提法 称取300 g粉碎广枣，转移至3 000 mL烧杯中，加入4 g复合酶，加水量以用布袋挤压时不滴水为标准，充分混合，室温放置24 h，加水补足至2 400 mL，在45 ℃摇床上提取3 h，重复3次，合并提取液，减压浓缩至原体积的10%，加入浓缩液体积5倍量的95%乙醇，沉淀静置24 h，抽滤，依次用乙醇、甲醇、乙醚洗涤，减压抽滤，低温干燥，即得酶提浅灰色粗多糖。

2.2 多糖纯化 采用Sevage法脱蛋白，将三氯甲烷-正丁醇混合溶液(4∶1)与多糖溶液充分混合，振摇，脱蛋白，重复上述操作至无蛋白为止(茚三酮检验)。取已脱蛋白的不同提取方法所得广枣多糖，溶解在水中，转移至分子量3 500 kDa的透析袋中透析，将无机盐、小分子物质、果胶等成分分离掉，即得纯度较高的多糖。

2.3 多糖分子量测定 采用高效凝胶色谱法测定，色谱图见图1～4，结果见表1。

图1 水提多糖高效凝胶色谱图

图2 酶提多糖高效凝胶色谱图

图3 超声多糖高效凝胶色谱图

图4 碱提多糖高效凝胶色谱图

表1 多糖分子量测定结果

2.4 多糖提取率比较 按公式提取率=(提取得到多糖质量/原料质量)×100%进行计算，结果水提、酶提、超声、碱提多糖提取率分别为10.66%、17.3%，12.0%、10.0%。

2.5 多糖含量比较

2.5.1 供试品溶液制备 称取4种提取方法所得多糖各10.0 mg，置于4个密封管中，加入1 mL蒸馏水充分溶解，再加入1 mL 2 mol/L稀硫酸，封口，沸水浴水解1.2 h，冷却至室温，加水定容至10 mL，即得。

2.5.2 对照品溶液制备 精密量取葡萄糖对照品0.010 2 g，溶于100 mL量瓶中，超纯水定容，即得。

2.5.3 线性关系考察 分别吸取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，加到6只比色管中，蒸馏水补足1 mL，每只试管中加入1.5 mL 5%苯酚溶液，再分别加入5 mL浓硫酸，摇匀，静止22 min，在490 nm波长处测定吸光度。以葡萄糖质量浓度为横坐标(X)，吸光度为纵坐标(A)进行回归,得方程为A=0.793 3X+0.083 86(r=0.999 4)，在0.008～0.120 mg/mL范围内线性关系良好。

2.5.4 多糖含量测定 取供试品溶液数量，稀释至规定质量浓度后在490 nm波长处测定吸光度，代入“2.5.3”项下回归方程，测得水提、酶提、超声、碱提多糖含量分别为90.9%、90.5%、85.6%、82.3%。

2.6 理化性质考察

2.6.1 溶解性 取4种提取方法所得多糖少量，分别置于乙醚、三氯甲烷、二甲亚枫、水中，发现多糖均易溶于水，微溶于二甲亚砜，不溶于有机溶剂，pH值为6.0。

2.6.2 熔点 取4种提取方法所得多糖少量，夹在2片盖玻片中间，置于熔点仪上加热，发现多糖在超过300 ℃时均开始变色，但不熔融。

2.6.3 三氯化铁实验 取4种提取方法所得多糖少量，依次加入1 mL乙醇、1 mL 1 mol/L盐酸、1滴5%FeCl3溶液，发现多糖与5%FeCl3溶液反应后显黄色。

2.6.4 碘-碘化钾反应 取4种提取方法所得多糖少量，发现碘-碘化钾溶液反应均呈阴性。

2.7 波谱分析

2.7.1 紫外光谱 将4种提取方法所得多糖分别溶于超纯水中，在190～800 nm波长处进行紫外吸收光谱扫描，结果见图5。

图5 多糖紫外吸收光谱扫描图

2.7.2 红外光谱 采用KBr压片法，将4种提取方法所得多糖在4 000～400 cm-1波数范围内进行扫描，特征峰见表2。

表2 多糖红外光谱特征峰(cm-1)

2.7.3 X射线粉末 将4种提取方法所得多糖研成细粉，采用X射线衍射仪扫描，扫描范围20°～100°(2θ)，均未发现有明显谱线的谱图。

2.8 抗氧化活性研究

2.8.1 羟自由基(·OH) 准确量取1.50 mL 0.2 mol/L PBS缓冲液(pH 7.4)，依次加入0.7 mL 2.0 mmol/L EDTANa2·Fe(Ⅱ)溶液、1.0 mL 0.4 mg/mL供试品溶液、0.4 mL 6% H2O2溶液、0.2 mL 0.52 mg/mL番红花红T溶液，超纯水定容至5 mL，混合均匀，37 ℃水浴反应30 min，在520 nm波长处测定吸光度，空白值以1.0 mL超纯水代替供试品溶液，对照值以1.7 mL超纯水代替供试品溶液和EDTANa2·Fe(Ⅱ)溶液，重复测定5次，计算清除羟自由基活性的抑制率，公式为抑制率=[(A样品-A空白)/(A对照-A空白)]×100%，其中A样品表示加入供试品溶液后的吸光度，A空白表示以水代替供试品溶液时得到的吸光度，A对照表示以水代替供试品溶液和EDTANa2·Fe(Ⅱ)溶液时的吸光度，结果见图6。

图6 抗羟自由基活性与抑制率的关系

2.8.2 超氧自由基(·O2-) 准备7只具塞试管，标记1～7号，在1号试管中加入3 mL Met-NBC(在反应时放在暗处)，2号试管中加入3 mL Met-NBC、0.1 mL VB2作为空白样品，3～7号试管中依次加入3 mL Met-NBC、0.1 mL VB2、不同质量浓度的4种提取方法所得多糖溶液，荧光灯光照30 min，在560 nm波长处测定吸光度，重复5次，结果见图7。

图7 抗超氧自由基活性与抑制率的关系

3 讨论

3.1 提取率及多糖含量比较 4种方法中酶提法的提取率最高为17.3%，较排第二的超声法高出5.3%，酶提多糖的含量虽然不是最高(90.5%)，但与最高的水提法(90.9%)仅相差0.4%，这是因为酶提法属于生物方法，能有效保存多糖生物活性。

3.2 理化性质与波谱比较 4种方法所得多糖水溶性好且显中性、没有烯醇式和酚羟基结构，不含蛋白质和淀粉，在300 ℃以下对热稳定。由表1、图1～4可知，水提、酶提、超声多糖的数均分子量和重均分子量以及分散度基本一致，而碱提多糖的数均分子量和重均分子量较小，而分散度较大。紫外光谱进一步验证，广枣多糖没有氨基结构。X射线显示，4种提取方法所得多糖均为无定形体。红外光谱显示，4种提取方法所得多糖均有多糖的特征峰，α-和β-吡喃糖苷键,具有多种生物活性，是一种活性多糖，具有开发潜力。

3.3 多糖抗氧化性比较 由图6～7可知，多糖抗羟自由基活性IC50值顺序为酶提法、水提法、超声法、碱提法、甘露醇；多糖抗超氧自由基活性的IC50值顺序为酶提法、水提法、碱提法、超声法、甘露醇。酶提和水提多糖的抗氧自由基的曲线形状近似，几乎重合，说明酶提和水提多糖抗氧自由基活性非常接近，而超声多糖抗羟自由基较碱提多糖好，碱提多糖抗超氧自由基较超声多糖好，表明4种提取方法所得多糖均有很强的抗氧化性，远远高于对照品甘露醇，且抑制率与浓度呈正相关。

综上所述，4种方法获得的广枣多糖均不含氨基，重均分子量除碱提多糖外，都在10 kDa以上，是无定形大分子粉末。其中酶提法得到多糖的提取率最高，多糖抗氧化性最好，多糖含量很高，且操作简单、耗能低，所以广枣多糖最佳提取方法为酶提法。另外广枣多糖提取率(17%以上)、含量(90%以上)较其他植物多糖高，且广枣价格低廉，是获得植物活性多糖非常好的原料之一，有广阔的应用前景和开发潜力。