乌天麻多酚提取工艺的优化

罗紫屹， 朱顺耀， 周衡朴， 丁美红， 石森林

(浙江中医药大学药学院，浙江 杭州 310053)

天麻为常用中药，来源于兰科植物天麻GastrodiaelataBl.的干燥块茎[1]，2020版《中国药典》记载其性甘、平，归肝经，具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络等功效，可用于治疗小儿惊风、癫痫抽搐、破伤风、头痛眩晕、手足不遂、肢体麻木、风湿痹痛等症，含有多酚、有机酸、甾醇等成分，具有改善睡眠、抗抑郁、抗癫痫、抗氧化等多种生物活性[2-5]，其中多酚含量最高，占总成分的52%，包括31%酚类、21%柠檬酸酯类[6-7]。由于种质差异，天麻被分为多种变型，如乌天麻、红天麻、黄天麻、绿天麻，以乌天麻质量最好、价格最高，被称为天麻中的“黑金”[8]。为了更好发挥乌天麻质量优势，并为其相关产品的开发奠定基础，本实验采用熵权法结合正交试验优化该药材提取工艺，以期为相关制剂的开发提供参考资料。

1 材料

1.1 仪器 H-Class超高效液相色谱仪(美国Waters 公司)；XS105分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；Avanti J-26XP系列高效离心机[贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司]；JA2003N电子天平(上海精密仪器有限公司)； KQ-300DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂与药物 天麻素(批号PS0120103)、巴利森苷A(批号PS011140)、巴利森苷B(批号PS011138)、巴利森苷C(批号PS011140)、巴利森苷E(批号PS012053)对照品(成都普思生物科技有限公司)；对羟基苯甲醇对照品(中国食品药品检定研究院，批号111970-201702)。乌天麻购自四川省乐山市金口河区森宝公司，经浙江中医药大学石森林教授鉴定为乌天麻GastrodiaelataBl. form. Glauca S. Chow的根茎。甲醇、乙腈为色谱纯(美国Tedia公司)；磷酸为色谱纯[阿拉丁试剂(上海)有限公司]；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 多酚含量测定

2.1.1 供试品溶液制备 将鲜药材冷冻干燥后打粉，过60目筛，取0.5 g至具塞锥形瓶中，加入一定料液比甲醇，称定质量，超声(500 W、40 kHz)处理30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，离心，取上清液4 mL至5 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取对照品天麻素2.83 mg、对羟基苯甲醇1.67 mg、巴利森苷A 5.04 mg、巴利森苷B 4.65 mg、巴利森苷C 1.10 mg、巴利森苷E 3.13 mg至25 mL量瓶中，50%甲醇溶解定容至刻度，配制成每1 mL分别含六者0.113 2、0.066 8、0.201 6、0.186 0、0.044、0.125 2 mg的溶液，即得。

2.1.3 色谱条件 ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流动相乙腈(A)-0.05%磷酸(B)，梯度洗脱(0～5 min，3.0%～10.0%A；5～10 min，10.0%～20.0%A；10～14 min，20.0%～25.0%A；14～14.1 min，25.0%～3.0%A；14.1～16 min，3.0%A)；体积流量0.3 mL/min；柱温30 ℃；检测波长220 nm；进样量1 μL。

2.1.4 专属性试验 吸取对照品、供试品溶液及空白溶剂各1 μL，在“2.1.3”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分均可达到基线分离，溶剂无干扰，可满足检测分析要求。

1.天麻素 2.对羟基苯甲醇 3.巴利森苷E 4.巴利森苷B5.巴利森苷C 6.巴利森苷A图1 各成分 UPLC色谱图

2.1.5 线性关系考察 取“2.1.2”项下对照品溶液，逐级稀释至系列质量浓度，在“2.1.3”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系

2.1.6 精密度试验 取对照品溶液适量，在“2.1.3”项色谱条件下进样测定6次，测得天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E峰面积RSD分别为0.37%、0.69%、0.86%、0.68%、0.89%、0.65%，表明仪器精密度良好。

2.1.7 稳定性试验 取供试品溶液适量，于0、4、6、8、18、24 h在“2.1.3”项色谱条件下进样测定，测得天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E峰面积RSD分别为1.37%、0.69%、0.65%、0.68%、0.89%、0.86%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.8 重复性试验 取同一批药材，按“2.1.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1.3”项色谱条件下进样测定，测得天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 含量RSD 分别为1.45%、1.26%、1.19%、2.24%、1.99%、1.21%，表明该方法重复性良好。

2.1.9 加样回收率试验 精密移取各成分含量已知的药材6份，每份2 mg，精密加入100%水平对照品，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.3”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E平均加样回收率分别为97.70%、96.74%、104.09%、98.77%、99.55%、103.72%，RSD分别为1.80%、1.87%、1.73%、3.46%、1.63%、1.63%。

2.2 单因素试验 采用回流提取法提取多酚后，以乙醇体积分数(60%、70%、80%、100%)，提取时间(1、2、2.5、3 h)、料液比(1∶8、1∶10、1∶12、1∶16)、提取次数(1、2、3次)为影响因素，纯度[(各成分含量/干浸膏质量)×100%]、转移率[(提取工艺中各成分含量/原药材中各成分含量)×100%]为评价指标。

2.2.2 料液比筛选 取药材粉末约5 g，分别按料液比1∶8、1∶12、1∶16、1∶20加入70%乙醇，在80 ℃下回流提取1 h，滤过，提取液蒸干，称定干浸膏质量，取适量用3%乙腈溶解，置于25 mL量瓶中，12 000 r/min离心15 min，0.22 μm微孔滤膜过滤，在“2.1.3”项色谱条件下进样测定，每个水平平行3次，按“2.2.1”项下方法计算综合评分，结果见图2。最终，选择料液比为1∶12。

图2 料液比对综合评分的影响

2.2.3 提取温度筛选 取药材粉末约5 g，按料液比1∶12加入70%乙醇，分别在65、75、85、95 ℃下回流提取1 h，其余操作同“2.2.2”项，按“2.2.1”项下方法计算综合评分，结果见图3。最终，选择提取温度为85 ℃。

图3 提取温度对综合评分的影响

2.2.4 提取次数筛选 取药材粉末约5 g，共9份，按料液比1∶12加入70%乙醇，在85 ℃下分别回流提取1、2、3次，每次1 h，其余操作同“2.2.2”项，按“2.2.1”项下方法计算综合评分，结果见图4。最终，选择提取次数为2次。

图4 提取次数对综合评分的影响

2.2.5 提取时间筛选 取药材粉末约5 g，共12份，按料液比1∶12加入70%乙醇，在85 ℃下分别回流提取1、2、2.5、3 h，其余操作同“2.2.2”项，按“2.2.1”项下方法计算综合评分，结果见图5。最终，选择提取时间为2 h。

2.2.6 乙醇体积分数筛选 取药材粉末约5 g，共12份，按料液比1∶12分别加入40%、60%、80%、100%乙醇，在85 ℃下回流提取2 h，其余操作同“2.2.2”项，按“2.2.1”项下方法计算综合评分，结果见图6。最终，选择乙醇体积分数为80%。

图5 提取时间对综合评分的影响

图6 乙醇体积分数对综合评分的影响

2.3 正交试验 在单因素试验基础上，固定提取次数为2次，提取时间为2 h，选择乙醇体积分数(A)、提取温度(B)、料液比(C)作为影响因素，“2.2.1”项下综合评分作为评价指标，取药材粉末约5 g，共9份，设计3因素3水平正交试验，因素水平见表2，结果见表3，方差分析见表4。

表2 因素水平

表3 正交试验结果

表4 方差分析

由表4可知，各因素影响程度依次为B(提取温度)>C(料液比)>A(乙醇体积分数)，但均无显著影响(P>0.05)。由表3可知，各水平影响程度依次为A2>A3>A1、B3>B2>B1、C2>C1>C3。最终确定，最优工艺为A2B3C3，即乙醇体积分数80%，提取温度85 ℃，料液比1∶12。

2.4 验证试验 按“2.3”项下优化工艺进行3批验证试验，结果见表5，可知该工艺稳定可行。

表5 验证试验结果(n=3)

3 讨论与结论

本实验以乌天麻中6种主要多酚类成分(天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A)纯度、转移率为评价指标[9]，采用熵权法确定权重系数，可避免常用分析方法存在主观因素影响的缺陷[10]，有利于客观真实地分析正交试验结果。

巴利森苷类化合物是乌天麻主要酚苷类成分，前期已从该药材中分离鉴定出三十余种[11-12]，具有改善中枢神经系统病变[13-14]、缓解糖尿病[15-17]等生物活性，故本实验选择其不同衍生物作为对照品。在乌天麻多酚含量测定过程中，本实验对流动相(水、甲醇、乙腈、甲酸水、磷酸水)组成和比例[18]、检测波长等条件进行了摸索，考虑到该类成分以酸性为主，故选择耐水相、耐酸性的C18色谱柱，最终获得稳定可靠的“2.1.3”项下色谱条件。

综上所述，乌天麻多酚最优提取工艺为按1∶12料液比加入80%乙醇，85 ℃水浴回流提取2次，每次2 h，综合评分为64.66分，该方法简便经济，稳定可行，适合工业化生产，也可为相关制剂生产及质量控制研究提供指导。