菘蓝种质资源评价

杨福红， 赵 鑫， 王 盼， 刘 东， 陈红刚， 王惠珍， 杜 弢*

(1.甘肃中医药大学和政药用植物园，甘肃 和政 731200；2.平凉市农业科学院，甘肃 平凉 744000；3.西北中藏药协同创新中心，甘肃 兰州 730000)

菘蓝IsatisindigoticaFort.是十字花科菘蓝属两年生草本植物，野生种质资源难以找到，故对各地栽培种群的保护利用尤为重要[1]。目前，有关菘蓝种质资源、板蓝根质量评价方面的研究较多，前者主要采用农学、分子生物学、中药化学等方法[2-5]，而后者包括传统鉴别法、显微鉴别法、药用成分含量比较法、指纹图谱法、重金属、农药残留等多种手段[4-8]，但均存在一定的片面性，难以全面客观地进行综合评价。

近年来，灰色关联度分析、DTOPSIS法广泛应用于作物品种、种质资源评价[9-18]，前者能从事物发展趋势的整体进行分析，将影响结果的各评价指标合一后进行评价，可更客观确定其权重，也更接近真实情况[9-12]；后者依据评价对象最优解与最劣解的距离进行排序，即最接近最优解的最优，最接近最劣解的最差，但缺点是各性状指标权重受主观因素影响太大，两者联用可同时综合农学、药学多种指标，更全面有效地评价种质资源[13-17]。本实验测定菘蓝农学性状和板蓝根中主要成分含量，并联合应用灰色关联度分析与DTOPSIS法对该种质资源进行综合评价，以期为构建中药材种质资源综合评价模型提供参考依据。

1 材料

27份菘蓝种质资源由平凉市农科院提供，经专家鉴定为正品，具体见表1。

表1 种质资源信息

2 方法

2.1 农艺指标测定 采用随机区组设计，无重复，每份资源种植1个小区，小区面积为3.5 m2(长3.5 m，宽1 m)，于2019年4月24日播种，播种量为10 g，行距30 cm，10月下旬对27份种质资源进行农艺性状的调查和产量测定，每份选取10株，指标包括株高、株幅、叶片大小、叶片数、单株叶重、根长、根粗、单株根重、侧根数、侧根重，收获后测量叶、根产量。

2.2 含量测定 参照柴俊雯[7]、张剑光[8]等报道加以完善，采用HPLC法测定板蓝根中尿苷、鸟苷、(R,S)-告依春、腺苷含量。

2.2.1 色谱条件 Agilent C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相水(A)-甲醇(B)，梯度洗脱(0～10 min, 10%B; 10～15 min, 17%B; 15～20 min, 20%B; 20～25 min, 20%B; 25～30 min, 25%B; 30～35 min, 30%B; 35～37 min, 35%B; 37～45 min, 30%B; 45～50 min, 10%B; 50～60 min, 10%B)；体积流量1.0 mL/min；检测波长254 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。色谱图见图1。

1.尿苷 2.鸟苷 3.(R,S)-告伊春 4.腺苷1.uridine 2.guanosine 3.(R,S)-goitrin 4.adenosine图1 各成分HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取尿苷、鸟苷、(R,S)-告依春、腺苷对照品适量，加水定容至10 mL棕色量瓶中，超声处理5 min，制成质量浓度分别为0.072 4、0.069 0、0.206 0、0.035 95 mg/mL的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液制备 将板蓝根粉碎后过3号筛，精密称取1 g，加50 mL水至150 mL具塞锥形瓶中，称定质量，超声处理50 min，加水补足减失的质量，取上清液，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.4 方法学考察 线性关系考察结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。取同一对照品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得尿苷、鸟苷、(R,S)-告依春、腺苷峰面积RSD分别为0.42%、0.44%、0.39%、0.47%，表明仪器精密度良好。取同一份供试品溶液，于0、2、4、8、12、24、36 h在“2.2.1”项色谱条件下进样测定7次，测得尿苷、鸟苷、(R,S)-告依春、腺苷峰面积RSD分别为1.04%、1.33%、2.89%、1.13%，表明溶液在36 h内稳定性良好。取同一批样品1 g，共5份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得尿苷、鸟苷、(R,S)-告依春、腺苷峰面积RSD分别为1.29%、0.77%、2.52%、0.81%，表明该方法重复性良好。精密称取各成分含量已知的同一批样品9份，分别按80%、100%、120%水平精密加入对照品溶液，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得尿苷、鸟苷、(R,S)-告依春、腺苷平均加样回收率分别为97.00%、98.32%、97.59%、96.84%，RSD分别为2.06%、3.50%、1.85%、2.20%。

表2 各成分线性关系

3 结果

结果，各性状指标的权重依次为鸟苷含量>尿苷含量>根长>侧根高>叶长>株幅>叶片数>根粗>株高>(R,S)-告依春含量>叶产量>腺苷含量>侧根数>根产量>单株根重>叶宽>单株叶重>侧根重，见表4。

表3 各种质资源性状指标

表4 性状指标灰色关联度及关联序

表5 DTOPSIS法结果

由此可知，Ci值前五位的为河北2018-1、2008-11、2008-6-2、隆德菘蓝、张掖菘蓝；加权关联度值排名前五位的为2008-6-2、河北2018-1、2008-11、2015-2-3、杨凌菘蓝；板蓝根产量排名前五位的为2008-11、杨凌菘蓝、河北菘蓝、2008-6-2、张掖菘蓝；(R,S)-告依春含量排名前五位的为2008-6-6-1-1、 2008-11、杨凌诱变1、2008-10、2015-2-3，表明依据加权关联度、Ci值的排列顺序在整体上变化不大，而依据板蓝根产量或(R,S)-告依春含量时变化较大，故灰色关联度分析结合DTOPSIS法的评价效果比仅依靠产量或药用成分更全面可靠。另外，河北2018-1、2008-11、2008-6-2 3种种质资源的综合表现较好，可作为育种材料或优良品系。

3.3 聚类分析 采用DPS软件对27份种质资源的Ci值、加权关联度进行聚类分析，结果见图2～3，发现均可分为4类，并且除河北菘蓝外聚类情况一致，但排列顺序有变化，综合表现依次为A类>B类>C类>D类。

图2 Ci值聚类分析Fig.2 Cluster analysis for Ci values

4 讨论

单独应用灰色关联度分析或DTOPSIS法在农作物的种质资源评价和品种比较中应用较多[15-24]，单独利用DTOPSIS法在评价种质资源或品种时，在确定各性状的权重时常依靠经验进行人为的赋值权重，造成评价结果受主观因素影响较大[12-15]。灰色关联度分析能够从整体出发，通过对数据的标准化处理和构建理想品种，从而确定各性状的权重，克服了人为因素的影响。近年来，结合两种方法在农作物种质资源评价和品种比较中应用提高了分析结果的可靠性和全面性[18-24]。本试验利用灰色关联度和DTOPSIS法对27份菘蓝种质资源进行综合评价，克服了单一依靠产量，或某一种或几种药用成分含量作为评价指标单一性、片面性和主观性，其评价结果更加客观公正。为菘蓝种质资源的综合评价提供了一种新的思路和方法。通过对27份菘蓝种质资源的综合评价，筛选出优质育种材料河北2018-1、2008-11和2008-6-2，可作为育种材料或优良品系生产上使用，同时为中药材种质资源综合评价提供新的思路和方法。因试验对种质资源的指标测定不够全面，特别是对抗病性、生育期、抗冻性等指标未测定，对试验结果有一定程度的影响，在以后的试验中进一步完善，为育种提供更加可靠的评价依据。