番荔枝果皮弱极性成分研究(Ⅳ)

2022-06-15陈亚运谢华永王丽媛

中成药 2022年5期

陈亚运，谢华永，王丽媛

(1.泰州职业技术学院，江苏泰州 225300；2.南京中医药大学，江苏南京 210023)

番荔枝又名林檎、释迦果，为番荔枝科植物番荔枝AnnonasquamosaLinn.的果实，原产于美洲中部，我国引种后已在云南、广西、广东等地形成一定种植规模，其果实可治恶疮肿痛[1]，种子因含有内酯类成分而对多种肿瘤细胞具有杀伤作用[2-4]。研究者从番荔枝果皮醇提物中发现了具有抗肿瘤活性的对映-贝壳杉烷型二萜[5]；课题组前期研究证明了番荔枝果皮的抗肿瘤活性，并从中分离出多种该类二萜[6-10]。本实验对番荔枝果皮弱极性成分进行分离，从中得到7个化合物，其中1为新化合物，2、3、5、7为首次从番荔枝果皮中分离得到。

1 材料

Avance-400型核磁共振仪(德国Bruker公司)；Xevo G2-XS Q-TOF高分辨液质联用仪、2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Affinity-1S型傅立叶变换红外光谱仪(日本Shimadzu公司)；UV-1800PC-DS2型紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；SMP10型熔点测定仪(英国Stuart公司)；RE-52A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；ZF-1型紫外分析仪(上海舒源分析仪器厂)。柱色谱硅胶(100、200～300目)、TLC硅胶G薄层板(青岛海洋化工有限公司)。番荔枝果实于2016年10月购自云南省临沧市秀川生物科技公司，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为番荔枝科植物番荔枝AnnonasquamosaLinn.的成熟果实，人工剥离后风干备用(留样编号20161025zh)。甲醇为色谱纯(江苏汉邦科技有限公司)；95%乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇为分析纯(广东光华科技股份有限公司)；氘代试剂(DMSO-d6、CDCl3，美国剑桥公司)。

2 提取与分离

将8 kg果皮粉碎成粗粉，10倍量95%乙醇渗漉提取，合并提取液，减压浓缩后得到浸膏400 g，乙酸乙酯溶解，100目硅胶拌样，200～300目硅胶柱色谱分离，石油醚-乙酸乙酯(1∶0、50∶1、25∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5、0∶1)、乙酸乙酯-甲醇(100∶1、50∶1、10∶1、0∶1)洗脱，每1 L为1个流分，TLC追踪并合并相同流分，共得到15个部位段Fr.1～Fr.15。Fr.3装入细长型AgNO3硅胶柱，石油醚-丙酮(20∶1)洗脱，2次分离后得化合物3(16.5 mg)。Fr.5部位经干法拌样后装入硅胶柱，石油醚-丙酮(50∶1～1∶1)洗脱，分为5段Fr.5.1～Fr.5.5，Fr.5.1、Fr.5.2合并后石油醚-丙酮(100∶1～20∶1)洗脱，得化合物1(31.5 mg)；Fr.5.5以硅胶柱分离，石油醚-丙酮(10∶1)洗脱，得化合物6(23.2 mg)。Fr.6分为3段Fr.6.1～Fr.6.3经硅胶柱分离，石油醚-丙酮(5∶1～1∶2)洗脱，得化合物4(34.1 mg)、5(22.8 mg)。Fr.7、Fr.8质量相对较低，而且均有白色沉淀，故合并后抽滤，滤液Fr.8.2经硅胶柱分离，二氯甲烷-甲醇(10∶1～2∶1)洗脱，得化合物2(8.4 mg)、7(11.7 mg)。

3 结构鉴定

化合物1：白色粉末，易溶于甲醇，mp 223～224 ℃。UV光谱未见明显吸收峰，IR光谱中2 950 cm-1吸收峰，此为CH2片段；又可见3 200～3 500、1 000 cm-1左右的吸收峰，表明结构中有多个OH存在。HRESI-MSm/z:293.248 0[M+H]+，分子式为C19H32O2，不饱和度为4。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)显示有2个甲基δH0.92 (s, 3H, H-20), 0.96 (s, 3H, H-19)。结合13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) 和HSQC可确认有19个碳信号，包括2个甲基、10个亚甲基、4个次甲基、3个季碳。结合文献[11]，可知该化合物为对映-贝壳杉烷型二萜且与annosquamosin C相似。在HMBC谱中，根据OH (δH3.89)对C-3 (δC43.0)、C-4 (δC70.4)、C-5 (δC57.2)、C-19 (δC22.9)的相关，可推断出OH位于C-4上；OH (δH4.28)与C-17 (δC62.4)的相关可推断出CH2OH的存在；H-13 (δH2.08)、H-15 (δH1.00)对C-17 (δC62.4)的相关可推断出CH2OH为17位，具体见表1。NOESY谱中OH (δH3.89)/H-3 (δH1.46, 1.59)的相关信号表明，C-4位的OH在平面上方，为β型，而CH3在19位，为α型；H-17 (δH3.45)/H-13 (δH2.08)、H-17 (δH3.45)/H-14 (δH2.04)的相关信号表明C-17在平面下，为α型，见图1。综上所述，化合物1命名为16β-17-hydroxy-18-nor-ent-kaurane-4β-ol，经SciFinder数据库检索未见相关报道，表明该化合物为新的对映-贝壳杉烷型二萜。

表1 化合物1的1H-NMR、13C-NMR波谱数据

图1 化合物1 HMBC和NOESY相关Fig.1 HMBC and NOESY correlations of compound 1

化合物2：白色粉末，易溶于甲醇，分子式C20H30O4，HRESI-MSm/z:333.205 9[M-H]-。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ:12.00 (1H, s, H-17)，12.00 (1H, s, H-18)，1.09 (3H, s, H-18)，0.86 (3H, s, H-20)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ:40.3 (C-1)，18.2 (C-2)，37.7 (C-3)，42.1 (C-4)，56.0 (C-5)，22.3 (C-6)，40.9 (C-7)，45.0 (C-8)，54.5 (C-9)，39.0 (C-10)，18.8 (C-11)，30.7 (C-12)，40.4 (C-13)，37.6 (C-14)，44.2 (C-15)，44.5 (C-16)，178.1 (C-17)，28.6 (C-18)，178.6 (C-19)，15.3 (C-20)。对比文献[12]，鉴定为16β-ent-kaurane-17,19-dioic acid。

化合物3：无色针晶，易溶于二氯甲烷，分子式C21H32O2，HRESI-MSm/z: 315.195 5[M-H]-。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 2.06 (3H, s, COCH3)，1.27 (3H, s, H-19)，0.96 (1H, s, H-20)。13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 41.5 (C-1)，18.2 (C-2)，36.4 (C-3)，37.1 (C-4)，56.8 (C-5)，20.4 (C-6)，40.4 (C-7)，44.2 (C-8)，56.2 (C-9)，39.2 (C-10)，18.2 (C-11)，33.2 (C-12)，44.0 (C-13)，39.6 (C-14)，49.1 (C-15)，155.8 (C-16)，103.0 (C-17)，27.6 (C-18)，67.2 (C-19)，18.1 (C-20)，171.4 (OCOCH3)，21.0 (OCOCH3)。对比文献[13]，鉴定为ent-kaurane-16-en-18-ol, acetate。

化合物4：白色粉末，易溶于甲醇，分子式C20H32O3，HRESI-MSm/z: 319.228 3[M-H]-。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 11.99 (1H, s, H-19)，4.04 (1H, s, 16-OH)，1.22 (3H, s, H-17)，1.09 (3H, s, H-18)，0.88 (3H, s, H-20)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 40.7 (C-1)，19.2 (C-2)，38.1 (C-3)，43.3 (C-4)，55.9 (C-5)，22.4 (C-6)，42.2 (C-7)，45.1 (C-8)，56.5 (C-9)，39.6 (C-10)，18.4 (C-11)，27.0 (C-12)，48.2 (C-13)，37.5 (C-14)，58.0 (C-15)，77.4 (C-16)，24.9 (C-17)，29.0 (C-18)，179.1 (C-19)，15.8 (C-20)。对比文献[14]，鉴定为16α-hydroxy-ent-kaurane-19-oic acid。

化合物5：白色粉末，易溶于甲醇，分子式C20H30O4，HRESI-MSm/z: 333.207 7[M-H]-。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 11.83 (1H, s, H-17)，11.83 (1H, s, H-19)，1.11 (3H, s, H-18)，0.87 (3H, s, H-20)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 40.5 (C-1)，19.3 (C-2)，38.1 (C-3)，43.3 (C-4)，56.4 (C-5)，22.4 (C-6)，41.7 (C-7)，44.3 (C-8)，56.2 (C-9)，39.5 (C-10)，18.2 (C-11)，27.6 (C-12)，39.2 (C-13)，40.3 (C-14)，42.0 (C-15)，45.3 (C-16)，175.9 (C-17)，29.0 (C-18)，179.1 (C-19)，15.8 (C-20)。对比文献[15]，鉴定为16α-ent-kaurane-17,19-dioic acid。

化合物6：白色粉末，易溶于甲醇，分子式C19H32O3，HRESI-MSm/z: 307.204 7[M-H]-。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 4.53 (1H, s, 16-OH)，3.92 (1H, s, 4-OH)，3.58 (1H, s, 17-OH)，1.10 (3H, s, H-18)，1.01 (3H, s, H-20)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 40.4 (C-1)，18.2 (C-2)，41.4 (C-3)，70.5 (C-4)，56.4 (C-5)，18.7 (C-6)，41.8 (C-7)，43.5 (C-8)，54.9 (C-9)，39.3 (C-10)，19.7 (C-11)，27.2 (C-12)，41.0 (C-13)，38.5 (C-14)，53.1 (C-15)，79.0 (C-16)，70.0 (C-17)，31.2 (C-18)，17.7 (C-20)。对比文献[16]，鉴定为ent-kaurane-19-nor-4α,16α,17-triol。

化合物7：白色粉末，易溶于甲醇，分子式C20H28O4，HRESI-MSm/z: 331.190 5[M-H]-。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 12.00 (1H, s, H-17)，12.00 (1H, s, H-18)，0.92 (3H, s, H-19)，0.86 (3H, s, H-20)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 39.7 (C-1)，18.2 (C-2)，37.7 (C-3)，42.8 (C-4)，55.5 (C-5)，20.1 (C-6)，42.8 (C-7)，49.8 (C-8)，45.2 (C-9)，37.6 (C-10)，18.8 (C-11)，25.0 (C-12)，39.9 (C-13)，39.0 (C-14)，151.6 (C-15)，138.4 (C-16)，178.5 (C-17)，182.4 (C-18)，28.5 (C-19)，15.2 (C-20)。对比文献[17]，鉴定为ent-kaurane-15-en-17,18-dioic acid。