黄芪甲苷对川崎病冠脉损伤小鼠的保护作用

张菲菲， 成 芳， 马红芬， 康利娜， 贾碧红， 安 红

(邢台市人民医院，河北 邢台 054000)

川崎病是儿童时期常见的一种急性自限性血管炎，一般指黏膜皮肤淋巴结综合症，常见临床表现有发热、皮疹、眼结合膜充血、颈部非脓性淋巴结肿大等。调查显示，我国川崎病的发病率约为51/100 000，主要发生于5岁以内婴幼儿[1]，大多呈自限性，但仍有20%～25%可并发严重的心血管病，甚至引发心力衰竭[2]。因此，降低川崎病患儿冠脉并发症风险，保护其冠脉组织意义重大。

丙种球蛋白(IVIG)是川崎病常用的治疗药物，效果确切，并对冠脉损伤有一定的保护作用，但在并发冠脉损伤的川崎病患儿中IVIG的效果不理想[3]。黄芪甲苷可保护大鼠冠脉组织，减轻炎症浸润[4]，但各成分是否可减轻川崎病患者的冠脉损伤尚不明确。白介素-35(IL-35)可调控Janus激酶1(JAK1)/信号转导和转录激活子1(STAT1)通路参与川崎病所致的冠脉损伤，它属于免疫负调控分子，可增加JAK1、STAT1及其磷酸化表达，参与炎症反应，诱发冠脉组织炎症浸润[5-7]。因此，本研究建立C57BL/6小鼠川崎病冠脉损伤模型，探讨黄芪甲苷是否通过调控该信号通路来减轻川崎病所致的冠脉损伤。

1 材料

1.1 动物 清洁级C57BL/6小鼠58只，雌雄各半，4～6周龄，体质量18～22 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号SCXK(沪)2020-0002。

1.2 试剂与药物 干酪乳杆菌细胞壁提取物(湖南朗林生物资源股份有限公司，批号R1912105)；黄芪甲苷对照品(纯度≥99.6%，成都科程生物科技开发有限公司，批号201910145)；IVIG(成都蓉生药业有限责任公司，批号201908A103)。鼠IL-35、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)酶联免疫吸附实验(ELISA)检测试剂盒(上海信帆生物科技公司，批号RS1811102、RS1905137、R1904126)；苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(山东博科生物产业有限公司，批号201907A)；原位末端标记法(TUNEL)检测试剂盒(瑞士Roche公司，批号AR1904135007)；Trizol溶液(美国Invitrogen公司，批号1907125003)；逆转录试剂盒(德国Qiagen公司，批号R1812102C)；细胞裂解液(上海麦克林生化科技有限公司，批号CL18350)；蛋白质提取试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司，批号P190115)；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶(上海联迈生物工程有限公司，批号1910117)；兔单克隆抗体IL-35、JAK1、STAT1、p-STAT1，酶标记的羊多克隆抗体IL-35、JAK1、STAT1、p-STAT1[艾博抗(上海)贸易有限公司，批号R19101、R19072、R19038、R19041、R19117、R19091、R19108、R19026]。

1.3 仪器 FA-1 A型匀浆机(江苏盛蓝仪器制造有限公司)；TG22-WS型医用离心机(长沙湘锐离心机有限公司)；JB-5C型光学显微镜(上海光学仪器厂)；SP-723型分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；9700型聚合酶链反应(PCR)仪(美国ABI公司)；SE 600X Chroma型电泳仪(美国Hofer公司)；170-3940型转膜仪(美国Bio-Rad公司)；FluorChem R型号凝胶成像分析系统(美国ProteinSimple公司)。

2 方法

2.1 建模、分组及给药 参照川崎病冠脉损伤建模操作规程[8]，50只C57BL/6小鼠单次腹腔注射0.5 mg干酪乳杆菌细胞壁提取物，第5天按照文献[8]标准判断是否建模成功。将建模成功的小鼠随机分为模型组、IVIG组及黄芪甲苷低、中、高剂量，另取8只小鼠作为对照组，IVIG组腹腔注射2 mg/g IVIG(临床等效剂量)，黄芪甲苷低、中、高剂量组分别腹腔注射0.25、0.5、1.0 mg/kg黄芪甲苷(分别为临床等效剂量的1/2、临床等效剂量、临床等效剂量的2倍)，对照组、模型组均腹腔注射等容量生理盐水，于建模成功并分组后当天开始给药，每天1次，连续1周。

2.2 ELISA法检测血清及心脏组织IL-35、TNF-α、IL-6水平 小鼠断头取血，3 000 r/min离心15 min(离心半径8 cm)，取上清，即得血清；迅速剥离心脏，洗净后取心脏组织进行匀浆，12 000 r/min离心10 min(离心半径10 cm)，取上清液，即得心脏组织匀浆液，按照试剂盒说明书检测小鼠血清和心脏组织IL-35、TNF-α、IL-6水平。

2.3 HE染色观察冠脉病变情况 取小鼠冠脉组织，经固定、冲洗、脱水、包埋、切片、摊片、烤片、脱蜡后采用苏木素染色10 min，盐酸乙醇分化3～5 s，饱和碳酸锂返蓝，伊红复染，最后中性树胶封片，在光学显微镜下观察。

2.4 TUNEL法检测冠脉组织细胞凋亡率 按“2.3”项下方法制作组织切片，于脱蜡后加入蛋白酶K工作液，在37 ℃下反应30 min，室温固定30 min，按照TUNEL试剂盒说明书操作，棕黄色染色的细胞为冠脉组织凋亡细胞，随机选取5个不重复视野计算凋亡细胞占比，即为冠脉组织细胞凋亡率。

2.5 RT-qPCR法检测冠脉组织IL-35、JAK1、STAT1 mRNA表达 小鼠冠脉组织液氮研磨后按Trizol法提取总RNA，分光光度计检测其浓度，鉴定纯度，以1.8～2.0为合格，逆转录为cDNA。PCR反应体系为95 ℃ 30 s，95 ℃ 60 s，74 ℃ 90 s，70 ℃ 20 s，共35个循环，最后52 ℃ 10 min。以β-actin为内参基因，采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量，参照NCBI基因数据库设计引物序列，IL-35正向5′-TCGTATAGGCTTATAGCTATG-3′，反向5′-AGGCTAGAGGGAGAGCTTAG-3′，预计扩增产物长度240 bp；JAK1正向5′-CTGAGATTGAGAGGAGGTTA-3′，反向5′-GAGATC TCGAGAGGAGGCTATAGCTAG-3′，预计扩增产物长度320 bp；STAT1正向5′-CGCGATATATGCG GCGCGATATGC-3′，反向5′-GAGAGCTTAGGAGAG CTAG-3′，预计扩增产物长度256 bp；β-actin正向5′-AGGACTCTTAGAGCTAG-3′，反向5′-TAGAGC TTTCTAGAGCTAG-3′，预计扩增产物长度180 bp，委托宝生物工程(大连)有限公司合成。

2.6 Western blot法检测冠脉组织IL-35、JAK1、STAT1、p-STAT1蛋白表达 小鼠冠脉组织液氮研磨后用磷酸盐缓冲液冲洗，2 000 r/min离心10 min(离心半径8 cm)，沉淀物中加入裂解液提取蛋白，SDS-PAGE电泳，转膜，脱脂奶粉封闭，加入兔抗IL-35、JAK1、STAT1、p-STAT1单克隆抗体(1∶2 000、1∶1 000、1∶2 000、1∶2 000)，在4 ℃下孵育过夜，TBST缓冲液洗涤，加入酶标记的羊抗IL-35、JAK1、STAT1、p-STAT1多克隆抗体(稀释倍数1∶5 000、1∶10 000、1∶5 000、1∶5 000)，室温静置2 h，洗膜，加入化学发光液曝光显影，采用凝胶成像分析系统计算蛋白相对表达。

3 结果

3.1 造模情况 50只小鼠中48只建模成功，成功率为96.00%，分别为模型组9只、IVIG组10只、黄芪甲苷低剂量组10只、黄芪甲苷中剂量组10只、黄芪甲苷高剂量组9只，给药期间各组小鼠均无脱落。

3.2 黄芪甲苷对小鼠血清及心脏组织IL-35、TNF-α、IL-6水平的影响 如表1所示，与对照组比较，模型组小鼠血清及心脏组织IL-35水平均降低(P<0.05)；与模型组比较，IVIG组和黄芪甲苷各剂量组血清及心脏组织IL-35水平均升高(P<0.05)，并呈剂量依赖性(P<0.05)；黄芪甲苷高剂量组小鼠血清及心脏组织IL-35水平高于IVIG组(P<0.05)。与对照组比较，模型组小鼠血清及心脏组织TNF-α、IL-6水平均升高(P<0.05)；与模型组比较，IVIG组和黄芪甲苷各剂量组血清及心脏组织TNF-α、IL-6水平均降低(P<0.05)，并呈剂量依赖性(P<0.05)；黄芪甲苷高剂量组小鼠血清及心脏组织TNF-α、IL-6水平低于IVIG组(P<0.05)。

3.3 黄芪甲苷对小鼠冠脉病理变化的影响 如图1所示，对照组小鼠冠脉组织细胞排列致密、规整，血管内壁光滑，未见炎症细胞浸润；模型组小鼠冠脉组织细胞排列严重紊乱，血管内壁极度不光滑，可见较多炎症细胞浸润；黄芪甲苷低剂量组小鼠冠脉组织细胞排列明显紊乱，血管内壁明显不光滑，可见部分炎症细胞浸润；黄芪甲苷中剂量组和IVIG组冠脉组织细胞排列紊乱，血管内壁不光滑，可见少量炎症细胞浸润；黄芪甲苷高剂量组冠脉组织细胞排列稍有紊乱，血管内壁欠光滑，可见较少炎症细胞浸润。

3.4 黄芪甲苷对小鼠冠脉组织细胞凋亡率的影响 如表2、图2所示，与对照组比较，模型组小鼠冠脉组织细胞凋亡率升高(P<0.05)；与模型组比较，IVIG组和黄芪甲苷各剂量组小鼠冠脉组织细胞凋亡率均降低(P<0.05)，并呈剂量依赖性；黄芪甲苷高剂量组小鼠冠脉组织细胞凋亡率低于IVIG组(P<0.05)。

表1 各组小鼠血清及心脏组织IL-35、TNF-α、IL-6水平

图1 各组小鼠冠脉病变(HE染色，×400，50 μm)Fig.1 Mouse coronary artery lesions in each group (HE staining, ×400, 50 μm)

表2 各组小鼠冠脉组织细胞凋亡率

图2 各组小鼠冠脉组织TUNEL染色(×400，50 μm)Fig.2 TUNEL staining of mouse coronary tissues in each group(×400, 50 μm)

3.5 黄芪甲苷对小鼠冠脉组织IL-35、JAK1、STAT1 mRNA表达的影响 如表3所示，与对照组比较，模型组小鼠冠脉组织IL-35 mRNA表达降低(P<0.05)；与模型组比较，IVIG组和黄芪甲苷各剂量组小鼠冠脉组织IL-35 mRNA表达均升高(P<0.05)，并呈剂量依赖性；黄芪甲苷高剂量组小鼠冠脉组织IL-35 mRNA表达高于IVIG组(P<0.05)。与对照组比较，模型组小鼠冠脉组织JAK1、STAT1 mRNA表达均升高(P<0.05)；与模型组比较，IVIG组和黄芪甲苷各剂量组小鼠冠脉组织JAK1、STAT1 mRNA表达均降低(P<0.05)，并呈剂量依赖性；黄芪甲苷高剂量组小鼠冠脉组织JAK1、STAT1 mRNA表达均低于IVIG组(P<0.05)。

3.6 黄芪甲苷对小鼠冠脉组织IL-35、JAK1、STAT1、p-STAT1蛋白表达的影响 如表4所示，与对照组比较，模型组小鼠冠脉组织IL-35蛋白表达降低(P<0.05)；与模型组比较，IVIG组和黄芪甲苷各剂量组小鼠冠脉组织IL-35蛋白表达均升高(P<0.05)，并呈剂量依赖性；黄芪甲苷高剂量组小鼠冠脉组织IL-35蛋白表达高于IVIG组(P<0.05)。与对照组比较，模型组小鼠冠脉组织JAK1、STAT1、p-STAT1蛋白表达均升高(P<0.05)；与模型组比较，IVIG组和黄芪甲苷各剂量组小鼠冠脉组织JAK1、STAT1、p-STAT1蛋白表达均降低(P<0.05)，并呈剂量依赖性；黄芪甲苷高剂量组小鼠冠脉组织JAK1、STAT1、p-STAT1蛋白表达高于IVIG组(P<0.05)。

表3 各组小鼠冠脉组织IL-35、JAK1、STAT1 mRNA表达

表4 各组小鼠冠脉组织IL-35、JAK1、STAT1、p-STAT1蛋白表达

4 讨论

川崎病冠脉损伤的发生和发展机制复杂，急性炎症、免疫失衡、氧化应激损伤等均可能参与川崎病并发心血管病的进程[9-10]。在川崎病患儿急性期和亚急性期，外周血T淋巴细胞处于异常免疫激活状态，以T细胞亚群失衡为主要表现，而T细胞异常激活可导致炎症细胞因子合成和分泌紊乱，其中IL-35水平下降，TNF-α与IL-6水平则升高[11-13]。黄芪具有补气固表、养血补气、补中益气等功效，具有抗氧化、减轻炎症反应和保护心肌组织的作用，黄芪甲苷是黄芪的主要成分，且在既往报道中发现黄芪甲苷还可增强机体免疫力，调节T淋巴细胞亚群的水平和生物学活性[14-15]。因此，本研究探讨了黄芪甲苷防治川崎病冠脉损伤的作用。

IVIG属于一种重要的免疫调节剂，可增强免疫力，调节免疫平衡，IVIG静脉注射治疗川崎病患儿疗效确切[16]，且对冠脉损伤也有一定的防治作用，故本研究选用IVIG作为阳性对照药物。此外，本研究采用干酪乳杆菌细胞壁提取物腹腔注射建立川崎病冠脉损伤小鼠模型，成功率达96.00%[17]，证实采用该方法可支撑完成本次实验。本研究结果发现，与对照组比较，模型组小鼠血清及心脏组织IL-35水平降低，TNF-α、IL-6水平及冠脉组织细胞凋亡率均升高，冠脉组织呈严重病理改变；而给予IVIG和黄芪甲苷干预后，以上指标均有改善。提示，黄芪甲苷和IVIG均可减轻小鼠川崎病炎症反应和冠脉组织损伤，减少冠脉组织细胞凋亡，且高剂量黄芪甲苷的效果优于低、中剂量黄芪甲苷和IVIG。

川崎病所致的冠脉损伤与炎症反应有着密切关系。IL-35属于白介素-12家族的重要成员，可由调节性T细胞、CD4+T细胞、内皮细胞及平滑肌细胞等产生和分泌，可抑制炎症反应，调节免疫平衡，在多种炎症与自身免疫性疾病中其水平均下降。血清IL-35水平下降很可能是症状性冠脉疾病的预测因子，也是冠脉心肌功能的关键因素[18]。在川崎病早期，调节性T细胞与CD4+T细胞活性下降，IL-35减少，是引发炎症反应、导致冠脉损伤的重要病因[19]。一方面，IL-35水平下降可激活JAK1/STAT1通路，增加STAT1磷酸化表达，JAK1和STAT1均有促凋亡、促炎症作用，在冠脉炎症损伤、冠脉细胞缺血缺氧性变性及凋亡等病理改变中均积极参与且均有较强的活性[20-21]。另一方面，IL-35可负向调控效应T细胞，其水平下降可使得分泌TNF-α、IL-6等因子的免疫细胞活性增加，共同参与川崎病所致的冠脉炎及组织炎症浸润[22]。本研究中显示，模型组小鼠冠脉组织IL-35 mRNA和蛋白表达均低于对照组，p-STAT1蛋白表达及JAK1、STAT1 mRNA和蛋白表达均高于对照组；黄芪甲苷各剂量和IVIG干预后，以上指标均有改善。提示，黄芪甲苷能够是通过上调IL-35表达，抑制JAK1/STAT1信号通路转导，下调JAK1、STAT1、p-STAT1表达，发挥对小鼠川崎病冠脉损伤的保护作用。黄芪甲苷的作用呈剂量依赖性，且高剂量黄芪甲苷效果更优，提示黄芪甲苷在川崎病冠脉病变防治方面有良好的价值。

综上所述，黄芪甲苷和IVIG均可增加血清及心脏组织IL-35水平，降低TNF-α、IL-6水平，减轻炎症反应和冠脉组织病理改变，减少冠脉组织细胞凋亡，呈剂量依赖性，且高剂量黄芪甲苷的效果更优。黄芪甲苷可能是通过上调IL-35表达，抑制JAK1/STAT1信号通路，下调JAK1、STAT1、p-STAT1表达，实现对小鼠川崎病冠脉损伤的保护作用。