黄芪甲苷对急性心力衰竭大鼠心肌线粒体能量代谢的影响

王天宝，马冬璞，刘毓，吕菲菲，王澈

（1.郑州大学附属郑州中心医院CCU，河南郑州 450000；2.阜外华中心血管病医院心脏大血管外科，河南郑州 451464）

急性心力衰竭（acute heart failure，AHF）是由于急性发作的心脏结构和功能异常引起心肌收缩和（或）舒张力降低，导致组织和器官灌注不足，造成体循环和（或）肺循环淤血的一组临床综合征。研究认为，心力衰竭与心肌能量供应不足或代谢失衡有关，改善心肌能量代谢有利于提高心功能，延缓病情进展程度[1-2]。黄芪甲苷是中药黄芪中皂苷类的主要成分，具有抗炎、抗病毒、免疫调节等广泛药理活性。动物实验证实，黄芪甲苷具有器官保护作用，对脓毒症、呼吸衰竭模型动物心、肺、肠组织均有抗损伤作用[3-4]。既往研究显示，黄芪甲苷可通过减少心肌纤维化改善大鼠慢性心力衰竭[5]，也可联合曲美他嗪调节心力衰竭犬心肌能量代谢，维持心肌细胞的功能[6]。此外，黄芪甲苷对糖尿病心肌病动物也具有改善其能量代谢的作用[7]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是能量代谢的关键调节物，过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）与能量代谢失衡有关，AMPK/PPARα通路在能量代谢中发挥关键作用。但黄芪甲苷是否是通过调控AMPK/PPARα通路，调节能量代谢，发挥心肌保护作用？鉴于此，本研究通过建立AHF大鼠模型，旨在探讨黄芪甲苷通过调控AMPK/PPARα通路对AHF的改善作用，以期为临床提供实验参考。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物清洁级雄性SD大鼠65只，7周龄，体质量200~220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK（京）2016-0006]，饲养于郑州大学药物研究院，动物许可证号：SYXK（豫）2018-0004，于温度23~25℃，相对湿度60%~70%，12 h明暗交替，清洁通风环境中适应性饲养7 d，动物自由采食饮水。

1.2 药物、试剂与仪器黄芪甲苷（纯度＞98%；分子量：784.97；分子式：C41H68O14；批号：190723）购自成都曼斯特生物科技有限公司。AMPK抑制剂复合物C（批号：C2313-100）购自美国Sigma公司；三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、一磷酸腺苷（AMP）酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒购自美国Cloud-Clone公司；甘油三酯（TG）、游离脂肪酸（FFA）测试盒购自南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠AMPK、p-AMPK、PPARα等抗体（一抗）和辣根过氧化物酶（HRP）标记的免疫球蛋白（二抗）购自美国Abcam公司。小动物高分辨超声成像系统购自加拿大VisualSonics公司；JEM-1400透射电镜购自日本JEOL公司。

1.3 建模、分组与干预随机选取55只大鼠，参照万嘉洋等[8]的方法，采用结扎冠状动脉左前降支法建立AHF模型。10 g/L戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉大鼠，进行气管插管，连接呼吸机，观察心电图变化。左侧胸骨前缘备皮，作一切口约2 cm，钝性分离肌肉，暴露心脏，于左心耳下2~3 mm处，使用6-0线结扎冠状动脉左前降支，若左心室内压最大上升速率降低≥40%且维持5 min以上，视为建模成功。缝合皮肤，肌肉注射青霉素10万U/只，连续3 d，防止感染。另取10只大鼠，开胸，但不结扎，余步骤同上，设为假手术组。将建模成功的40只大鼠随机分为模型组、复合物C组、黄芪甲苷组、黄芪甲苷+复合物C组，每组10只。建模成功1 h后开始干预。参照文献研究[9-10]用量进行干预：黄芪甲苷+复合物C组，腹腔注射15 mg/kg复合物C、灌胃30 mg/kg黄芪甲苷；复合物C组，腹腔注射15 mg/kg复合物C、灌胃生理盐水；黄芪甲苷组，腹腔注射生理盐水、灌胃30 mg/kg黄芪甲苷；假手术组和模型组，均腹腔注射生理盐水、灌胃生理盐水。均为每天1次，连续干预4周。

1.4 观察指标与方法

1.4.1 超声心动图检测心功能末次干预12 h后，麻醉大鼠，使用小动物超声检测系统，频率为15 mHz，速度为3 cm，于左心室乳头肌水平进行M型超声检测，测量大鼠左室收缩末期内径（LVESD）、左室舒张末期内径（LVEDD）和左室射血分数（LVEF）。计算左室短轴缩短率（raction shortening，FS），FS=（LVEDD-LVESD）/LVEDD×100%。连续检测5个心动周期，取平均值。

1.4.2 ELISA法检测血清ATP、AMP、ADP水平超声检测完毕，心脏采血5 mL，以3 000 r/min（离心半径10 cm）离心10 min，取上清，按照ELISA试剂盒说明书步骤进行操作。反应结束后，使用酶标仪在450 nm波长处读取吸光度值，根据标准曲线计算血清中ATP、AMP、ADP含量。

1.4.3 全心质量指数（HMI）和左心室质量指数（LVMI）计算称定大鼠体质量。处死后，取出心脏，放入KB缓冲液（95% O2，5% CO2）4℃漂洗，剔除非心肌组织，滤纸吸干，称全心质量，计算HMI。HMI=全心质量（mg）/体质量（g）。剪除左心房、右心房、右心室和室间隔，去除大血管，称左心室质量，计算LVMI。LVMI=左心室质量（mg）/体质量（g）。

1.4.4 心肌组织FFA、TG水平检测取300 mg心肌组织，加入生理盐水制备10%组织匀浆，以3 000 r/min（离心半径8 cm）离心10 min，取上清。TG采用氧化酶法，FFA采用比色法，按照试剂盒说明书步骤操作检测心肌组织FFA、TG水平。

1.4.5 HE染色观察左心室病理变化取部分左心室组织于40 g/L中性甲醛溶液中固定48 h后，以乙醇作为脱水剂，从低浓度逐渐增加，进行脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，切片机切片（片厚约4 μm），90℃烘干，进行HE染色，光镜下观察心肌病理学改变特征。

1.4.6 透射电镜观察心肌超微结构取心肌组织，修剪为1 mm×1 mm×2 mm的小块，4%戊二醛固定2 h，PBS洗涤2次×5 min，10 g/L四氯化锇固定2 h，PBS洗涤2次×5 min；梯度浓度乙醇脱水，丙酮浸透，包埋，60℃加热24 h，切片，片厚约1 μm；光镜下定位，进行超薄切片，厚约50 nm，醋酸铀和枸橼酸铅各染色10 min，透射电镜下观察心肌超微结构变化。

1.4.7 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测心肌组织AMPK、p-AMPK、PPARα蛋白表达取100 mg心肌组织，加入组织裂解液，冰上裂解，以14 000 r/min（离心半径12 cm）离心15 min，取上清；二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白浓度后，与上样缓冲液混匀，煮沸10 min蛋白变性；制备凝胶，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）分离蛋白；采用湿转法将蛋白转至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，加入含有50 g/L脱脂奶粉的TBST溶液中，室温封闭2 h；加入1∶1 000稀释的AMPK、p-AMPK、PPARα一抗工作液，4℃孵育过夜；TBST溶液洗膜，加入1∶4 000稀释HRP标记的相应二抗，室温孵育1 h；TBST溶液洗膜，使用电化学发光（ECL）试剂盒显色，凝胶成像系统内检测蛋白条带荧光，曝光后分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白的相对表达水平。

1.5 统计方法采用SPSS 25.0统计软件进行数据的统计分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心功能指标比较LVESD、LVEDD、LVEF、FS水平各组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与假手术组比较，模型组、复合物C组、黄芪甲苷组、黄芪甲苷+复合物C组LVESD、LVEDD增加，LVEF、FS减小（均P＜0.05）；与模型组比较，复合物C组LVESD、LVEDD增加，LVEF、FS减小，黄芪甲苷组、黄芪甲苷+复合物C组LVESD、LVEDD减小，LVEF、FS增加（均P＜0.05）；与复合物C组比较，黄芪甲苷组、黄芪甲苷+复合物C组LVESD、LVEDD减小，LVEF、FS增加（均P＜0.05）；与黄芪甲苷组比较，黄芪甲苷+复合物C组LVESD、LVEDD增加，LVEF增加、FS减小（均P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠心功能指标比较Table 1 Comparison of cardiac function indexes in various groups of rats

①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与复合物C组比较；④P＜0.05，与黄芪甲苷组比较

FS/%52.57±4.13 29.24±3.25①21.63±3.11①②42.37±4.08①②③36.68±3.89①②③④102.533＜0.001组别假手术组模型组复合物C组黄芪甲苷组黄芪甲苷+复合物C组F值P值鼠数/只10 10 10 10 10 LVESD/mm 3.41±0.32 7.38±0.51①9.06±0.72①②4.76±0.49①②③5.92±0.48①②③④180.035＜0.001 LVEDD/mm 7.19±0.51 10.43±0.65①11.56±0.72①②8.26±0.59①②③9.35±0.62①②③④76.958＜0.001 LVEF/%79.43±4.69 59.26±4.03①51.37±4.58①②65.46±3.32①②③74.41±4.15①②③④73.013＜0.001

2.2 各组大鼠血清ATP、AMP、ADP含量比较血清ATP、AMP、ADP各组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与假手术组比较，模型组、复合物C组、黄芪甲苷组、黄芪甲苷+复合物C组血清ATP降低，AMP、ADP升高（均P＜0.05）；与模型组比较，复合物C组血清ATP降低，AMP、ADP升高，黄芪甲苷组、黄芪甲苷+复合物C组血清ATP升高，AMP、ADP降低（均P＜0.05）；与复合物C组比较，黄芪甲苷组、黄芪甲苷+复合物C组血清ATP升高，AMP、ADP降低（均P＜0.05）；与黄芪甲苷组比较，黄芪甲苷+复合物C组血清ATP降低，AMP、ADP升高（均P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清ATP、AMP、ADP水平比较Table 2 Comparison of serum ATP，AMP and ADP levels in various groups of rats （±s，μg·L-1）

①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与复合物C组比较；④P＜0.05，与黄芪甲苷组比较

ADP 2 869.45±289.43 4 387.93±385.36①5 066.45±403.25①②3 259.48±363.56①②③3 894.78±378.51①②③④57.265＜0.001组别假手术组模型组复合物C组黄芪甲苷组黄芪甲苷+复合物C组F值P值鼠数/只10 10 10 10 10 ATP 863.59±136.32 428.14±114.58①303.62±106.25①②691.61±132.42①②③558.42±128.79①②③④31.151＜0.001 AMP 1 026.53±126.58 1 542.58±138.82①1 758.49±145.47①②1 235.97±129.24①②③1 391.84±136.87①②③④42.836＜0.001

2.3 各组大鼠HMI、LVMI比较HMI、LVMI各组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与假手术组比较，模型组、复合物C组、黄芪甲苷组、黄芪甲苷+复合物C组HMI、LVMI增加（均P＜0.05）；与模型组比较，复合物C组HMI、LVMI增加，黄芪甲苷组、黄芪甲苷+复合物C组HMI、LVMI减小（均P＜0.05）；与复合物C组比较，黄芪甲苷组、黄芪甲苷+复合物C组HMI、LVMI减小（均P＜0.05）；与黄芪甲苷组比较，黄芪甲苷+复合物C组HMI、LVMI增加（均P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠HMI、LVMI比较Table 3 Comparison of HMI and LVMI in various groups of rats （±s，mg·g-1）

表3 各组大鼠HMI、LVMI比较Table 3 Comparison of HMI and LVMI in various groups of rats （±s，mg·g-1）

①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与复合物C组比较；④P＜0.05，与黄芪甲苷组比较

组别假手术组模型组复合物C组黄芪甲苷组黄芪甲苷+复合物C组F值P值鼠数/只10 10 10 10 10 HMI 2.62±0.13 3.51±0.12①3.78±0.15①②2.94±0.11①②③3.35±0.13①②③④LVMI 1.89±0.10 2.53±0.11①2.79±0.12①②2.12±0.10①②③2.37±0.12①②③④50.328＜0.001 128.472＜0.001

2.4 各组大鼠心肌组织FFA、TG含量比较心肌组织FFA、TG各组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与假手术组比较，模型组、复合物C组、黄芪甲苷组、黄芪甲苷+复合物C组心肌组织FFA、TG含量增加（均P＜0.05）；与模型组比较，复合物C组心肌组织FFA、TG增加，黄芪甲苷组、黄芪甲苷+复合物C组心肌组织FFA、TG含量减少（均P＜0.05）；与复合物C组比较，黄芪甲苷组、黄芪甲苷+复合物C组心肌组织FFA、TG含量减少（均P＜0.05）；与黄芪甲苷组比较，黄芪甲苷+复合物C组心肌组织FFA、TG含量增加（均P＜0.05）。见表4。

表4 各组大鼠心肌组织FFA、TG含量比较Table 4 Comparison of contents of FFA and TG in myocardial tissue in various groups of rats（±s）

表4 各组大鼠心肌组织FFA、TG含量比较Table 4 Comparison of contents of FFA and TG in myocardial tissue in various groups of rats（±s）

①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与复合物C组比较；④P＜0.05，与黄芪甲苷组比较

组别假手术组模型组复合物C组黄芪甲苷组黄芪甲苷+复合物C组F值P值鼠数/只10 10 10 10 10 FFA/（mmol·g-1）0.59±0.08 1.72±0.15①2.01±0.14①②0.86±0.11①②③1.31±0.12①②③④TG/（μmol·g-1）20.13±3.16 55.26±4.12①67.49±5.67①②33.15±3.86①②③42.58±4.17①②③④93.527＜0.001 114.857＜0.001

2.5 各组大鼠心肌组织病理变化比较光镜下显示，假手术组心肌细胞排列整齐，心肌纤维呈束状，排列紧密有序，横纹、胞核清晰可见，心肌细胞形态正常，大小均匀，无水肿、坏死、变性等病理学改变，无炎性浸润；模型组心肌细胞排列混乱，肥大、水肿，有空泡，形态不规则，心肌纤维排列紊乱，出现断裂、肿胀，部分消失，炎性细胞浸润；复合物C组心肌细胞变性及炎性细胞浸润较模型组更加严重，心肌纤维溶解更多；黄芪甲苷组心肌细胞排列情况及炎性细胞浸润较模型组有明显改善，心肌纤维排列接近正常，改善效果最佳；黄芪甲苷+复合物C组较模型组有一定改善，心肌纤维断裂减少，炎性浸润减少，但较黄芪甲苷组差。见图1。

图1 各组大鼠心肌组织病理变化比较（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of pathological features of myocardial tissue in various groups of rats（by HE staining，×200）

2.6 各组大鼠心肌超微结构比较透射电镜下显示，假手术组心肌纤维排列整齐，线粒体形状规则，结构正常，嵴清晰可见；模型组线粒体破裂、溶解，部分可见肿胀，闰盘增宽，有空泡样变；复合物C组较模型组破坏更加严重，线粒体内部产生空泡，膜结构溶解，发生肿胀、变形；黄芪甲苷组线粒体较模型组有明显改善，形状和结构基本正常；黄芪甲苷+复合物C组较模型组有一定改善，线粒体形状较规则，嵴基本可见，但较黄芪甲苷组改善效果差。见图2。

图2 各组大鼠心肌超微结构比较（透射电镜，×10 000）Figure 2 Comparison ultrastructural changes of myocardial tissue in various groups of rats（by transmission electron microscope，×10 000）

2.7 各组大鼠心肌组织AMPK、p-AMPK、PPARα蛋白表达比较心肌组织p-AMPK、PPARα蛋白相对表达量各组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与假手术组比较，模型组、复合物C组、黄芪甲苷组、黄芪甲苷+复合物C组p-AMPK、PPARα蛋白相对表达量降低（均P＜0.05）；与模型组比较，复合物C组p-AMPK、PPARα蛋白相对表达量降低，黄芪甲苷组、黄芪甲苷+复合物C组p-AMPK、PPARα蛋白相对表达量升高（均P＜0.05）；与复合物C组比较，黄芪甲苷组、黄芪甲苷+复合物C组p-AMPK、PPARα蛋白相对表达量升高（均P＜0.05）；与黄芪甲苷组比较，黄芪甲苷+复合物C组p-AMPK、PPARα蛋白相对表达量降低（均P＜0.05）。心肌组织AMPK蛋白相对表达量各组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5、图3。

图3 心肌组织AMPK、p-AMPK、PPARα蛋白Western Blot电泳条带图Figure 3 Western Blotting electrophoresis bands diagram of AMPK，p-AMPK and PPARα in myocardial tissue

表5 各组大鼠心肌组织AMPK、p-AMPK、PPARα蛋白表达水平比较Table 5 Comparison of protein expression levels of AMPK，p-AMPK and PPARα in myocardial tissue in various groups of rats

表5 各组大鼠心肌组织AMPK、p-AMPK、PPARα蛋白表达水平比较Table 5 Comparison of protein expression levels of AMPK，p-AMPK and PPARα in myocardial tissue in various groups of rats

①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与复合物C组比较；④P＜0.05，与黄芪甲苷组比较

PPARα相对表达量1.15±0.10 0.43±0.07①0.29±0.06①②0.87±0.09①②③0.65±0.08①②③④89.485＜0.001组别假手术组模型组复合物C组黄芪甲苷组黄芪甲苷+复合物C组F值P值鼠数/只5 5 5 5 5 AMPK相对表达量1.03±0.12 1.06±0.11①1.02±0.11①②1.01±0.10①②③1.07±0.12①②③④0.266 0.896 p-AMPK相对表达量0.92±0.09 0.46±0.06①0.31±0.05①②0.78±0.08①②③0.59±0.07①②③④58.304＜0.001

3 讨论

心力衰竭是多种心血管病发展到终末阶段的严重表现，也是导致患者死亡的主要原因之一。目前，通过西药抑制心力衰竭后心室重构，可明显降低患者病死率，但在控制病情进展方面仍存在诸多不足。心力衰竭病因复杂，涉及多种因素共同参与，心肌能量代谢障碍在其中发挥关键作用，且与心力衰竭控制不佳有关[11]。心脏正常能量代谢对于维持心脏内环境稳定及心脏舒缩功能至关重要，发生心力衰竭后，心脏能量产生减少，引起心室重构，进而损害线粒体功能，进一步导致能量产生减少，促使心功能恶化，加重病情[12]。通过改变心力衰竭时心脏能量代谢，抑制心功能恶化，对延缓病情进展，提高患者预后具有重要意义。

AHF伴随心脏结构和功能改变。多种病因损伤心肌，负荷加重，导致心肌细胞结构、代谢及功能发生异常改变，心脏泵血功能下降，左心室发生适应性代偿性增大，进而结构和形状发生改变，心功能出现明显异常，左心室重构，心脏扩张，出现严重心力衰竭[13]。线粒体是维持心脏正常功能的能量来源，心力衰竭过程伴随线粒体功能受损及能量代谢障碍，ATP生成减少和转移过程受损，心肌细胞处于能量饥饿状态，引发细胞死亡，心功能受损[14]。心力衰竭后心脏发生代谢重塑，心肌能量代谢底物由脂肪酸转变为葡萄糖，FFA氧化利用减少，造成脂质沉积，加重心力衰竭进程[15]。本研究结果显示，模型组大鼠HMI、LVMI、LVESD、LVEDD水平明显大于假手术组，LVEF、FS减小，心肌发生组织学改变，电镜可见线粒体结构异常，ATP生成减少，分解增加，血清脂质沉积，提示AHF大鼠心室发生重构，心功能、线粒体结构以及能量代谢发生异常。有研究[16]表明，黄芪甲苷可通过调节心脏动态平衡，预防心脏重塑并恢复高胆固醇血症引起的心室功能受损。Jiang等[17]研究表明，黄芪甲苷可增强骨骼肌能量代谢减少细胞凋亡，对骨骼肌能量代谢紊乱有明显改善作用。本研究使用黄芪甲苷治疗AHF大鼠，心肌和线粒体结构明显减轻，血清ATP水平升高，AMP、ADP水平降低，心肌组织FFA、TG含量减少，提示黄芪甲苷可改善心肌能量代谢，改善AHF症状，延缓病程进展。

AMPK与糖脂代谢密切相关，在维持能量内环境稳定方面具有重要作用。ATP产生减少和消耗增加可激活AMPK，调节某些合成和耗能代谢活动，促使ATP生成增加，维持心脏正常功能。AMPK活化与心肌受损后心脏脂肪酸和葡萄糖代谢改变有关，在心肌能量代谢中发挥关键作用[18]。PPARα参与调节脂肪代谢酶的转录，其表达下调可导致脂肪酸氧化酶失活，引起脂肪代谢障碍，是介导心室重构能量代谢底物转变的重要介质之一。PPARα基因敲除小鼠心功能明显下降，PPARα活化可改善心脏能量代谢，提高心功能[19]。PPARα可增强线粒体脂肪酶活性，促进FFA氧化代谢，产生ATP，维持心功能。AHF发生发展过程中，心肌能量代谢底物改变影响线粒体功能，导致能量代谢障碍，不能满足心肌正常代谢所需，能量代谢重构进一步加重心室重构，促进病情进展。AMPK可作为PPARα上游激活物，调控PPARα表达，参与能量代谢。研究[20]显示，激活AMPK/PPARα信号通路，可改善肥胖小鼠脂肪代谢紊乱。体外研究[21]表明，激活AMPK/PPARα通路可减少糖尿病性心肌细胞凋亡，保护心肌细胞。本研究结果显示，模型组大鼠心肌组织p-AMPK和PPARα蛋白表达较假手术组明显降低，经黄芪甲苷治疗后，表达明显升高，表明黄芪甲苷可能对AMPK/PPARα通路具有调节作用。为进一步证实黄芪甲苷对AMPK/PPARα通路的调控作用，加以AMPK特异性抑制剂复合物C作用后发现，p-AMPK和PPARα表达明显降低，提示黄芪甲苷可能通过调控AMPK/PPARα信号通路，提高心肌能量代谢，恢复心功能，改善AHF症状。

综上所述，黄芪甲苷可明显改善大鼠AHF，其机制可能是通过激活AMPK/PPARα信号通路，提高了心肌能量代谢，改善了心功能。