不同核酸提取方法SARS-CoV-2核酸检测性能比较

【摘要】目的：研究不同核酸提取方法在SARS-CoV-2核酸检测中的应用性能。方法：选取3种经过预处理的核酸提取试剂作为观察对象，分别使用磁珠吸附法、样本释放剂A、样本释放剂B其进行提取，获取阴性样本、阳性样本，通过RNA技术获得20%～28%稀释度的SARS-CoV-2标准品，并使用荧光逆转录聚合酶反应（RT-PCR）对其进行检测，由此获得Ct值，随后评估不同提取方法下SARS-CoV-2核酸的检测性能。结果：不同核酸提取方法下，SARS-CoV-2试剂的阴性样本、阳性样本的检测符合率均是100%，使用磁珠吸附法获得的核酸样本变异系数（CV）与样本稀释法（A、B）比较降低，样本稀释剂A的CV值最大，稀释剂B的CV值次之。使用磁珠吸附法与样本释放剂B获得的核酸检出限为156mg/ml，低于样本释放剂A的检出限625.0mg/ml。结论：在SARS-CoV-2核酸试剂检测中，使用磁珠吸附法对试剂的提取效率更高，并且重复性好，在大批量SARS-CoV-2试剂样本检测中，可推广该提取方法。

【关键词】核酸检测方法;不同提取方法;SARS-CoV-2;检测性能

新冠病毒肺炎（COVID-19）的致病原为SARS-CoV-2，根据我国卫生健康委员会《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》（试行第7版）规定，通过RT-PCR检测SARS-CoV-2阳性即为新冠病毒感染患者。在具体检测中，相關人员按照试剂检测说明书，在磁珠吸附法的作用下，将采集的鼻咽拭子存放在保存液中，使用56℃的灭活疫苗，培养30min后，提取自动化设备，以聚合酶反应，对PCR模板进行扩增，以获取阳性样本。该方法的检测效率较高，并且操作便利、检测时间较短，具有推广价值。

1资料及方法

1.1一般资料

10例阳性样本资料为广州邦德盛公司提供的SARS-CoV-2RNA标准品，其浓度为2.0*106mg/ml，病毒核酸编号分别为GBW（B）092244、GBW（B）092243，10例阴性样本来源于健康体检者咽拭子。

使用的样本释放剂A为国盛医学科技有限公司提供。样本释放剂B阿、磁珠吸附法所用核酸提取试剂均来源于达安基因有限公司。检测所用的荧光定量PCR仪来源于瑞士罗氏公司。

1.2方法

根据核酸提取说明书，以样本释放剂A、样本释放剂B提取样本，将样本置入到采样管中灭活、对其进行震荡离心、选取上层清液作为PCR模板，并对其进行扩增。

参考磁珠吸附法、核酸提取试剂说明书，使用核酸提取仪器完成对CoV-2 RNA的自动提取，选取200μL的样本与核酸洗脱液体100μL，按照吸附法一般流程，对其进行吸附操作，并完成对样本的制备。

在具体操作中，使用RT-PCR实时荧光法与试剂盒，对制备后的SARS-CoV-2核酸进行检测，为实现理想的检验结果，需要对荧光RT-PCR的条件进行规定，第一次温度控制在50℃、时间为15min、第二次温度为90℃，时间为15min;第三次温度为55℃，吸附时间为45s。

1.3观察指标

观察检测结果符合率、判定检测结果为阳性、阴性的例数。其中阳性标准为FAM通道有明显扩增曲线，且循环阈值Ct≤40;阴性标准为FAM通道无扩增曲线，且Ct值>40。

2结果

2.1阳性与阴性符合率比较结果

采样人员使用不同方式采集了10例健康人群的咽拭子样本，其检测结果为阴性，阴性符合率为100%;对阳性样本进行检测分析，分别使用释放剂A、B与磁珠吸附法，对阳性样本进行复检，其中结果为阳性的样本为10例，符合率为100%。

2.2有关重复性指标的对比分析

对低值品与中值品进行核酸提取与扩增，利用磁珠吸附法和样本释放剂进行重复性检查，结果见表1：

2.3不同提取方法下的检出率比较

以磁珠吸附法提取核酸后，对N基因的检出率为100%，ORFlab基因的检出率为96.85%，采用样本释放剂A提取核酸后，N基因检出率为83.18%，ORFlab基因的检出率为76.82%，使用样本缓放剂B进行核酸提取后，N基因的检出率为100%，ORFlab基因的检出率为96.28%。

3讨论

COVID-19成为公共突发卫生事件，具有传播广泛的特点，对人民群众的健康构成威胁，目前，对COVID-19的检测方式为实时荧光RT-PCR标记，其样本的提取方式主要是磁珠吸附法。磁珠吸附法是通过蛋白变性剂使得样本中的蛋白质达到溶解状态，使得核酸被解离出来，并在磁场和重力的作用下，将杂质去除掉，最后获取较为纯净的核酸样本。样本试剂的主要成分为核酸释放液与保存液，在试剂作用下能够促使蛋白质结构变性。

采样完成后，操作人员需要严格按照试剂采样说明书，对样本进行震荡、静置与离心，吸取上层清液作为本次检测样本，将其置于PCR体系中，进行扩增。理论上分析，病毒载量越大，则提取的病毒核酸量越多，这一现象在检测结果的Ct值上有所体现。牛卫东、段江洋、蒋诗苑以咽拭子和鼻试子为主要方式对患者痰液中的SARS-CoV-2核酸进行了检测，通过PCR获取Ct值，其检测结果一致性（符合率）与检出率与本文研究结果高度相似。

综上所述，使用磁珠吸附法检测SARS-CoV-2核酸效果良好，与样本释放剂A、B比较，其符合率更高、重复性好，可对磁珠吸附法进行推广。

参考文献

[1]沈利华，黄菲，陈祥，等.严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）核酸检测试剂盒临床诊断效能评估[J].浙江大学学报：医学版，2020，49（2）：6.

[2]牛卫东，段江洋，蒋诗苑，等.咽拭子，鼻拭子，痰液中SARS-CoV-2核酸检测结果一致性及检出率分析[J].传染病信息，2020，33（4）：5.

作者简介：李俊平（1979.10-）女， 汉族，山东省聊城市高唐县人，本科学历，主管检验师，研究方向：医学检验。