黄连中1个新型生物碱的研究

孙 雨， 苏本正， 蒋海强， 王 珺， 于宗渊*

(1.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2.山东省中医药研究院，山东 济南 250014)

黄连CoptischinensisFranch为毛茛科黄连属植物，主产于四川峨眉、洪雅、彭州，重庆石柱、巫山，湖北利川等地[1]，在历代本草《名医别录》《唐本草》《本草纲目》中均有记载[2]，其中峨眉是道地主产区，其味苦性寒，无毒，归心、肝、胃、大肠经，具有清热解毒、止血凉血的功效[3]，具有多种药理活性，主要为抗菌[4]、抗炎、抗氧化[5]、降压及扩张血管、舒张平滑肌[6]、保护胃黏膜[7]、保护中枢神经细胞[8]、调血脂[9]、降血糖等[10-11]，具有较高的药用和保健价值[12-13]。目前，从黄连属植物中发现的生物碱均为异喹啉类生物碱，绝大多数为苄基异喹啉类，包括原小檗碱类、双苄基异喹啉类、阿朴菲类、苯菲啶类等，其中原小檗碱类又包括原小檗碱型、氧化原小檗碱型、甲基原小檗碱型、四氢原小檗碱型等，以季铵型生物碱为主[14]。大量研究表明，生物碱是黄连主要有效成分[15]，现已从中发现了四十多种，其中小檗碱、黄连碱、表小檗碱、巴马汀、药根碱在黄连总生物碱中的占比高达70%～80%，除此之外还含有木脂素、香豆素、黄酮、萜类、甾体、有机酸、挥发油、多糖等多种成分[16]。为深入探究黄连药理活性的物质基础，本实验对其化学成分进行了系统研究，通过1H-NMR、13C-NMR等波谱技术和从相近的极性环境中分离得到3个化合物，其中，化合物1为未见文献报道的新型苄基异喹啉生物碱，结构见图1。

图1 化合物1结构Fig.1 Structure of compound 1

1 材料

VANCE III-600型核磁共振仪(瑞士布鲁克公司)；UV3000型紫外光谱测定仪(日本日立公司)；NEXUS 670 FT-IR型红外光谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；Agilent 1260型高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱(HPLC-Q-TOF-MS)(美国Agilent公司)；半制备色谱柱ODS-2(20 mm×250 mm, 5 μm，天津博纳艾杰尔科技有限公司)；N-1100型旋转蒸发仪、CCA-1112A型低温冷却液循环泵(上海爱朗仪器有限公司)；Bio-Rad SHZ-DⅢ型循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；VG AutoSPE-3000光谱仪(德国斯派克分析仪器公司)；HP-Q-UV100型高压制备液相色谱仪(天津博纳艾杰尔科技有限公司)。

薄层色谱硅胶GF254(100 mm×100 mm)、柱色谱用硅胶(100～200、200～300目)(青岛海洋化工有限公司)。98%硫酸(重庆川东化工有限公司)；甲醇、乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯(国药集团化学试剂有限公司)；水为娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

黄连于2018年购自山东省济南百味堂中药饮片公司(批号180506)，经山东中医药大学药学院李峰教授鉴定为毛茛科黄连属黄连CoptischinensisFranch的根茎，样品保存放于山东中医药大学药学院药物化学实验室。

2 提取与分离

取黄连干燥根茎10 kg，75%乙醇室温浸渍提取3次，每次8 d，提取液过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇味，依次用石油醚(3×5 L)、二氯甲烷(3×5 L)、乙酸乙酯(3×5 L)、正丁醇(3×5 L)萃取，减压浓缩得二氯甲烷萃取物33.6 g，经硅胶柱(石油醚-乙酸乙酯梯度)洗脱，分离得到3个流分Fr.1～Fr.3。Fr.1经半制备HPLC(甲醇-水)洗脱，得到化合物1、2、3。

3 结构鉴定

在1H-NMR谱中，低场区有3组芳香氢的质子信号[δH8.37(1H, d,J=5.4 Hz, H-3)，7.86(1H, d,J=5.4 Hz, H-4)；7.49(1H, s, H-5)，7.38(1H, s, H-8)；7.31(1H, d,J=8.4 Hz, H-6′)，7.18(1H, d,J=8.4 Hz, H-5′)]、1个亚甲二氧基质子信号[δH6.24(2H, s)]，中场区给出1个连氧亚甲基质子信号[δH4.09(2H, q,J=7.2 Hz, COOCH2CH3)]，高场区给出1个甲基质子信号[δH1.18(3H, t,J=7.2 Hz, COOCH2CH3)]、2个甲氧基质子信号[δH3.92(3H, s, 4′-OCH3)，3.78(3H, s, 3′-OCH3)]。在13C-NMR谱中有22个碳信号，包括2个羰基碳信号[δC193.2(CO),δC166.1(C-1″)]、1组异喹啉碳信号[δC152.9(C-1)，150.9(C-7)，149.5(C-6)，140.3(C-5)，135.2(C-4a)，123.0(C-8a)，122.6(C-4)，112.8(C-8)，102.9(C-3)；156.6(C-4′)，145.7(C-3′)，129.9(C-2′)，129.6(C-5′)，127.8(C-1′)，100.6(C-6′)]、1个亚甲二氧基信号(δC102.4)、1个亚甲基碳信号[δC61.0(C-2″)]、2个甲氧基碳信号[δC61.3(3′-OCH3)，56.4(4′-OCH3)]、1个甲基碳信号[δC13.8(C-3″)]，通过数据分析和文献比对，推测化合物1可能为生物碱[17]，再通过 HSQC谱进一步将其1H-NMR、13C-NMR数据予以归属，见表1。

表1 化合物1的1H-NMR(600 MHz, DMSO-d6)和13C-NMR数据(150 MHz, DMSO-d6)Tab.1 1H-NMR(600 MHz, DMSO-d6) and 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6) data on compound 1

根据1H-1H COSY谱可知，H-3(1H, d,J=5.4 Hz)与H-4(1H, d,J=5.4 Hz)相耦合，结合HMBC谱(图2)中H-3与C-1(δ152.9)、C-4(δ122.6)、C-4a(δ135.2)相关，H-4与C-3(δ102.9)、C-5(δ140.3)、C-8a(δ123.0)相关，H-5(δ7.49, s)与C-6(δ149.5)、C-8a相关，H-8(δ7.38, s)与C-1、C-7(δ150.9)、C-4a相关，表明存在1个喹啉单元。结合碳谱、氢谱、HMBC谱中C-6、C-7的δC102.4、δH6.24(2H, s)发现，两者有1个亚甲二氧基与喹啉单元相连；根据C-1′(δ127.8)、C-2′(δ129.9)、C-3′(δ145.7)、C-4′(δ156.6)、C-5′(δ129.6)、C-6′(δ100.6)、H-5′(1H, d,J=8.4 Hz)、H-6′(1H, d,J=8.4 Hz)位移值，并结合HMBC谱中H-5′与C-1′、C-3′、C-4′、C-6′相关，H-6′与C-2′、C-5′、-CO-相耦合，提示存在1个1′,2′,3′,4′-4取代的苯环；δC193.2位于低场区，说明存在1个羰基，而且H-6′与其远程相关,说明羰基连在苯环的C1′位，同时羰基为强吸电子基团，会使相连C的化学位移值升高；在异喹啉环上，C1的化学位移值达到了152.9，在DEPT 135谱图中也没有发现化学位移值为152.9的碳，说明C1与羰基碳相连；在1H-NMR中存在化学位移值为3.92、3.78的2个单峰，表明存在2个甲氧基，HMBC谱中4′-OCH3(δ3.92)与C-4′相关，3′-OCH3(δ3.78)与C-3′相关，说明3′-OCH3、4′-OCH3分别与苯环上的C3′、C4′位相连；δH7.31、7.18的耦合常数为8.6 Hz，说明这2个氢处于邻位，而且δH7.31与C-6′直接相关，δH7.18与C-5′直接相关，表明δH7.31、δH7.18分别为C-6′、C-5′上的氢。H-2″(2H, q,J=7.2 Hz)与C-1″(δ166.1)、C-3″(δ13.8)相耦合，H-3″(3H, t,J=7.2 Hz)与C-2″(δ61.0)相耦合，H-2″与C-1″远程相关，说明存在1个-COOCH2CH3片段连在苯环的C2′位；C-1位移值表明异喹啉单元与1′,2′,3′,4′-4取代的苯环通过-CO-相连。综上所述，化合物1为1个新型异喹啉类生物碱，命名为6-([1,3]dioxolo[4,5-g]isoquinoline-5-carbonyl)-2,3-dimethoxybenzoic acid ethyl ester。

图2 化合物1的主要HMBC和1H-1H COSY相关Fig.2 Key HMBC and 1H-1H COSY correlations of compound 1

化合物2：白色粉末，ESI-MSm/z: 205.2[M+H]+,分子式C11H11NO3。1H-NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ:7.28(1H, s, H-8), 6.85(1H, s, H-5), 6.05(2H, s, -OCH2O-), 3.48(2H, t,J=6.6 Hz, H2-3), 2.98(3H, s, N-CH3), 2.86(2H, t,J=6.6 Hz, H2-4);13C-NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ:163.2(C-1), 47.4(C-3), 27.2(C-4), 123.0(C-4a), 106.8(C-5), 149.8(C-6), 146.2(C-7), 107.2(C-8), 134.1(C-8a), 34.5(N-CH3), 101.5(-OCH2O-)。以上数据与文献[18]报道基本一致，故鉴定为oxohydrastinine。

化合物3：白色粉末，EI-MSm/z: 358.4[M]+，分子式C20H22O6。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ: 6.88(2H, s, H-2′, 2″)，6.75(2H, dd,J=9.0 Hz, H-6′, 6″)，6.72(2H, d,J=9.0 Hz, H-5′, 5″)，4.60(2H, d,J=4.2 Hz, H-2, 6)，4.11(4H, m, H-4, 8)，3.76(6H, s, -OCH3×2)，3.03(2H, m, H-1,5)；13C-NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ:147.5(C-3′,3″), 146.0(C-4′,4″)，132.2(C-1′,1″)，118.7(C-6′,6″)，115.2(C-5′,5″)，110.4(C-2′,2″)，85.2(C-2,6)，70.9(C-4,8)，55.6(-OCH3×2)，53.6(C-1,5)。以上数据与文献[19]报道基本一致，故鉴定为pinoresinol。

4 讨论

黄连是一种极具特色的传统中药，中医临床上常用来清热解毒、预防上火、消炎杀菌，也常与其他中药组成复方来治疗各种疾病。本实验对黄连化学成分进行研究，采用多种分离纯化技术和鉴定手段，从其75%乙醇提取物的二氯甲烷部位中发现3个化合物，包括1个新型异喹啉类生物碱，可为该药材药效物质基础的研究提供依据，也为其深入开发利用奠定基础，但上述成分的具体活性尚不明确，还需进一步考察。